實(shí)驗(yàn)一兔血清 免疫球蛋白分離與純化.ppt

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1、綜合實(shí)驗(yàn)一兔血清免疫球蛋白分離與純化主講教師：申慧芳岳續(xù)朋生物工程教研室蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)課實(shí)驗(yàn)課要求預(yù)習(xí)不遲到、早退、不曠課、有事請(qǐng)假穿白大褂、注意自我防護(hù)不能喧嘩，不做與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的事認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒垃圾、關(guān)燈和門窗一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟五、注意事項(xiàng)六、數(shù)據(jù)處理及計(jì)算實(shí)驗(yàn)一兔血清免疫球蛋白分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握鹽析法的原理及用鹽析法進(jìn)行免疫球蛋白分離與純化的技術(shù)。（IgG）抗體結(jié)構(gòu)抗體分子是由兩條輕鏈(lightchain,L鏈)和兩條重鏈(heavychain,H鏈)通過

2、鏈間二硫鍵連接而成。二、實(shí)驗(yàn)原理一鹽析當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱甚至消失；同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀，這個(gè)過程叫做鹽析。實(shí)驗(yàn)原理-鹽析不同蛋白質(zhì)由于所帶電荷不同以及水化程度不同，加入不同濃度的中性鹽可分階段從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)鹽析中最常用的鹽是硫酸銨硫酸銨分級(jí)沉淀三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑1.實(shí)驗(yàn)材料：血清（兔免疫血清）。2.試劑：0.01mol/LpH7.4PBS、0.5mol

3、/LNaOH、0.5mol/LHCl、飽和硫酸按（用前以5mol/LNaOH調(diào)至pH7.4）、奈氏試劑。三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑3.用具：三角瓶、燒杯、各種吸管、小試管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或雙蒸水煮沸10min）、飯盒（裝碎冰）等。4.儀器：攪拌器、離心機(jī)等。5.溶液配制三、實(shí)驗(yàn)試劑飽和硫酸銨溶液的配制：稱（NH4）2SO4400～425克，以70～80℃之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水（28%氨溶液）調(diào)PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨，瓶底應(yīng)有結(jié)晶析出。磷酸鹽緩沖液0.2M，PH7.4磷酸鹽緩沖鹽

4、液（PhosphateBufferedSalinePBS）配制。貯存液：A液：0.2MNaH2PO4：NaH2PO4·2H2O31.2克，加蒸餾水至1000ml；B液：0.2MNa2HPO4：Na2HPO4·12H2O71.7克，加蒸餾水至1000ml；應(yīng)用液：取A液19ml加B液81ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋，加入NaCl至終濃度為0.85%，即為PBS。柰氏試劑HgI11.5g，KI8.0g，加雙蒸水至50ml；攪拌溶解后過濾，濾液中再加入濃度為20%的溶液NaOH50ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1兔免疫血清的制備2硫酸銨分級(jí)沉淀（1）取

5、制備好的血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4飽和溶液20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置10min。（2）3000r/min離心10min，棄去上清。（3）用6ml磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4飽和溶液3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，靜置10min。（4）3000r/min離心10min，棄上清。（5）為進(jìn)一步純化，可重復(fù)步驟32~3次。3透析去鹽（6）用5mlPBS溶解沉淀，裝入透析袋。（7）透析除鹽，中間換液數(shù)次，至奈氏試劑測(cè)透析外液無黃色。五、數(shù)據(jù)處理及計(jì)算蛋白

6、含量（mg/mL）＝（1.45×OD280nm－0.74×OD260nm）×樣品稀釋度注：式中1.45與0.74為常數(shù)，nm為波長(zhǎng)。蛋白質(zhì)及其定量鑒定：取樣品少許作適量稀釋，以紫外分光光度計(jì)測(cè)量蛋白含量260、280nm處讀數(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的要求題目、原理、主要試劑與器材、步驟、結(jié)果、注意事項(xiàng)（心得體會(huì)）班級(jí)、姓名、學(xué)號(hào)由學(xué)習(xí)委員統(tǒng)一收齊，按學(xué)號(hào)從小到大順序放好自己寫、書寫整齊訂成一本或每次分開