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1、兔血清白蛋白及IgG分離純化及鑒定摘要：目的：以兔血清白蛋白和IgG的分離純化與鑒定實驗為例，闡述了血清蛋白制備與分析的過程。方法：使用了硫酸鐵分級沉淀、凝膠過濾層析、DEAE離子交換層析、親和層析、醋酸纖維薄膜電泳、SDS-PAGE.HPLC等分離純化鑒定蛋白質(zhì)的方法。結(jié)果：制備了兔血清白蛋白和Y—球蛋白(IgG),測定被分離物質(zhì)的相對分子量，鑒定純化產(chǎn)品的均一性。結(jié)論：該實驗作為一門生物綜合性大型實驗，非常有利于培養(yǎng)學(xué)生掌握蛋白質(zhì)制備與分析的綜合技能。關(guān)鍵詞：分離純化；白蛋白；丫一球蛋白；實驗中圖分類號:Q5
2、03文獻標識碼：A文章編號：1008-2409(2007)03-0424-03血清白蛋白是人體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在血液中有重要生理功能，是血液總滲透壓的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，其濃度可以反映肝臟的功能，其水平的改變能導(dǎo)致一系列的病理性繼發(fā)癥。血清白蛋白的另一作用是作為脂肪酸的載體參與運送脂肪酸。此外，血清白蛋白還有重要的藥用價值，注射白蛋白針劑可治療浮腫等癥。血清球蛋白是血清蛋白質(zhì)的重要組成部分，能與外來的特異性抗原起免疫反應(yīng)而保護機體。檢查血清總蛋白及白、球蛋白的比值，即可了解肝臟受損害的程度?？偟鞍紫陆?、白/球蛋白比值
3、減少、電泳試驗Y—球蛋白增加，是肝炎的常見情況。因此，測定血清白蛋白常用于患者狀態(tài)的非特異監(jiān)視。1材料與方法1.1材料試劑與儀器1.1.1材料兔血清。1.1.2試劑飽和(NH4)2S04溶液、磷酸鹽緩沖液(pH6?3)、SephadexG—25、二乙氨乙基(DEAE)纖維素、三氯醋酸、0.5mol/L醋酸鐵緩沖液(pH6?5)、0.06mool/L醋酸鐵緩沖液(pH6?5)、0.02tool/L醋酸鐵緩沖液(pH6?5)、SPA-Sepharose—4B>結(jié)合緩沖液(pH8.9)、緩沖液I(pH7.0的PBS)、
4、緩沖液I(pH3.0的PBS).Tris-Hcl緩沖液(pH8?5)、檸檬酸溶液(pH3?0)、0.9%NaCI溶液、標準血清白蛋白液、考馬斯亮藍G250等。1.1.3儀器層析柱，離心機，恒流泵，核酸蛋白檢測儀，記錄儀，電泳儀，垂直平板電泳槽，微量注射器，Agilent-1100-高效液相色譜儀、紫外可見分光光度計等。1.2方法1.2.1血清白蛋白的分離與純化①硫酸鞍鹽析法制備粗白蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入飽和硫酸鞍溶液2.Omlo室溫靜置lOmin,3000r/min離心10mino移液槍小心吸
5、出上層清液作為純化白蛋白之用。②凝膠柱層析獲得除鹽白蛋白液：SephadexG~25層析柱以0.02mol/L醋酸鞍緩沖液(pH6.5)平衡，以流速lml/min洗脫粗制白蛋白液獲得除鹽的白蛋白液。核酸蛋白檢測儀在0.05A檔、走紙速度6cm/h.100mV,同時記錄吸光度值。③DEAE-纖維素離子交換層析柱分離白蛋白：裝好的DEAE-纖維索離子交換層析柱以0.02mol/L醋酸鞍緩沖液(pH6.5)平衡，將去鹽收集得的白蛋白液加到纖維素柱上，接上恒流泵，用0.06?0.5mol/L醋酸鐵緩沖液(pH6?5)以流
6、速為lml/min進行梯度洗脫。核酸蛋白檢測儀在0.05A檔、走紙速度6cm/h、100mV,同時記錄吸光度值。1.2.2血清.Y-球蛋白的分離與純化①硫酸鐵鹽析獲得粗制丫-球蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入飽和硫酸鐵溶液2.Omlo室溫靜置10min,3000r/min離心10min,用移液槍小心吸出上層清液作為純化白蛋白之用，沉淀用0.5ml的0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6?3)溶解作為純化Y-球蛋白之用。②凝膠柱層析獲得除鹽粗制丫-球蛋白液：SephadexG-25層析柱經(jīng)0.02mo
7、l/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)平衡后,0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6?3)以流速lml/min洗脫粗制丫-球蛋白液。核酸蛋白檢測儀在0.05A檔、走紙速度6cm/h、200mV,同時記錄吸光度值。③DEAE-纖維素離子交換層析柱分離Y-球蛋白：將裝好的DEAE-纖維素離子交換層析柱先經(jīng)0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.3）平衡后，在纖維素床面上以流速為1ml/min的0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.3）進行洗脫。核酸蛋白檢測儀在0.05A檔、走紙速度6cm/h、100mV,同時
8、記錄吸光度值。④親和層析法純化丫-球蛋白33：用恒流泵，以結(jié)合緩沖液平衡柱，流速為0.5ml/mino將DEAE-纖維素離子交換層析后的Y-球蛋白溶液上柱，用結(jié)合緩沖液洗柱。依次分別用5倍床體積的緩沖液I?I洗脫（流速0.5ml/min）,緩沖液I洗脫IgGl,緩沖液I洗脫IgG2。每管中預(yù)先盛有l(wèi)mol/LTris-Hcl緩沖液500ul,收集各吸收峰的蛋白液。透析除鹽
