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1、1轉(zhuǎn)基因植株對灰霉病的抗性鑒定 采用離體葉片接種法。當(dāng)幼苗長至4～5片真葉時,剪取葉齡相同及大小適中的葉片,葉柄以濕潤無菌脫脂棉包裹,用移液槍取20μL灰霉菌(B.cinerea)的孢子懸浮液(106cfu·mL-1)點(diǎn)于葉正面,在光周期12h/12h,溫度20℃左右條件下培養(yǎng)。以無菌的1%葡萄糖溶液接種為對照。分別在接種后4、6、8天調(diào)查發(fā)病情況?；颐共》旨墭?biāo)準(zhǔn)參照等。病情指數(shù)計算參照方中達(dá)的方法。每個處理取10片葉,重復(fù)3次。2.參照Viaud等[1]的離體葉片接種法:在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪雙層濾紙,加少量水,進(jìn)行滅菌。剪取生長整齊一致的
2、各供試寄主幼苗的第1片平展真葉,沖洗后用75%的酒精表面消毒30s,用滅菌水沖洗3遍,待吸干葉表水后,展平鋪到滅菌培養(yǎng)皿上。用直徑為3mm的打孔器在培養(yǎng)好的各地灰霉菌菌落邊緣打取菌餅,反接于葉片的不同部位。每片葉接4塊菌餅,每個菌株在每個寄主上接5片葉,對照接相同大小的PDA培養(yǎng)基塊。接種后置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi),3d后調(diào)查發(fā)病情況。按照十字交叉法測量病斑大小,并根據(jù)各處理的病斑大小評價各菌株致病力的差異。參照朱建蘭等[9]的灰霉病斑調(diào)查方法,其分級標(biāo)準(zhǔn)為:0級,無癥狀或癥狀不明顯;1級,形成直徑2~5mm(包含2mm)水漬狀黃
3、褐色病斑;2級,形成直徑5~10mm(包含5mm)水漬狀黃褐色病斑;3級,形成直徑10~15mm(包含10mm)水漬狀黃褐色病斑;4級,形成直徑15~20mm(包含15mm)水漬狀黃褐色病斑;5級,形成直徑≥20mm水漬狀黃褐色病斑。采用DPS統(tǒng)計軟件對供試灰霉菌株引起的病斑直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,采用Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)(LSRtest)進(jìn)行多重比較。3.采用孢子懸浮液點(diǎn)滴法。取幼苗的第3片復(fù)葉接種，在小葉中心近軸處用移液器加5μL孢子懸浮液，以無菌水作對照。將接種后的葉片置于直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，封口膜封口。在20℃、相對
4、濕度100%的黑暗條件下培養(yǎng)24h后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照時間為12h·d-1，光照強(qiáng)度為3000lx。接種4d后計算病情指數(shù)。每份試材3次重復(fù)，每重復(fù)10株，每株3片小葉。病害分級標(biāo)準(zhǔn)為:0級,無病斑;1級,病斑面積占葉面積5%以下;3級,病斑面積占葉面積5%～15%;5級,病斑面積占葉面積15%～25%;7級,病斑面積占葉面積25%～50%;9級,病斑面積占葉面積50%以上。病情指數(shù)的計算公式如下:病情指數(shù)=Σ(各級病葉數(shù)×各級代表值)調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值×100以病情指數(shù)為基礎(chǔ),采用相對抗病性方法評價其抗病程度,根據(jù)相對抗性指
5、數(shù)進(jìn)行抗性劃分。抗性水平分為:免疫(I)、高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS);相對抗性指數(shù):免疫(I)為1.00、高抗(HR)為0.70~0.99、中抗(MR)為0.40~0.69、中感(MS)為0.20~0.39高感病(HS)為<0.20
