酵母表達(dá)系統(tǒng).ppt

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1、酵母表達(dá)系統(tǒng)簡介基因工程技術(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)?；虮磉_(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應(yīng)的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有的加工過程就是基因表達(dá)的過程，它是在一系列酶和調(diào)控序列的共同作用下完成的?；蛑亟M的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)目的的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物。外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表

2、達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。外源基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)載體受體細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母（yeast）——是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌的特點(diǎn)：基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制比較清楚，遺傳操作相對簡便，并于1996年完成了對釀酒酵母基因組全序列的測定；具有原核生物所不具備的蛋白質(zhì)翻譯后加工和修

3、飾系統(tǒng)；可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；對人體和環(huán)境安全，不含毒素和特異性病毒；可進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵，工藝簡單而成熟，成本低廉。酵母基因表達(dá)載體酵母克隆和表達(dá)載體是由酵母野生型質(zhì)粒、原核生物質(zhì)粒載體上的功能基因（如抗性基因、復(fù)制子等）和宿主染色體DNA上自主復(fù)制子結(jié)構(gòu)（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等一起構(gòu)建而成。酵母基因表達(dá)系統(tǒng)的載體一般是一種穿梭質(zhì)粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制。選擇標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記：它與宿主的基因型有關(guān)。顯性選擇標(biāo)記：可用于各種類型的宿主細(xì)胞，并提供直觀的選擇標(biāo)記。DNA復(fù)制起始區(qū)酵母表

4、達(dá)載體包含兩類復(fù)制起始序列：在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起始序列在酵母菌中引導(dǎo)進(jìn)行自主復(fù)制的序列表達(dá)盒表達(dá)盒由啟動子、分泌信號序列和終止子等組成，是酵母表達(dá)載體的重要元件。啟動子的長度一般在1～2kb，其上游含各種調(diào)控序列（如上游激活序列、上游阻遏序列、組成型啟動子序列等），下游存在轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)和TATA序列（TATA序列可被質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子蛋白識別、結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物）。一般在構(gòu)建表達(dá)載體時須組入強(qiáng)啟動子，如酵母磷酸甘油酯激酶（PGK）基因啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH）基因啟動子等。分泌信號序列是前體蛋白N端一段長為17～30個氨基酸

5、殘基的分泌信號肽編碼區(qū)，主要功能是引導(dǎo)分泌蛋白從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，并對蛋白質(zhì)翻譯后的加工起重要作用。常用的分泌信號序列有：α因子前導(dǎo)肽序列、蔗糖酶信號肽序列、酸性磷酸酯酶信號肽序列等。終止子序列相對較短，是決定酵母中mRNA3′端穩(wěn)定性的重要結(jié)構(gòu)。與高等真核生物類似，mRNA的3′端需經(jīng)過前體mRNA的加工和多聚腺苷化反應(yīng)。酵母基因表達(dá)載體的種類自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（yeastreplicatingplasmid，YRP）該載體含有酵母基因組的DNA復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記和基因克隆位點(diǎn)等元件，能夠在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。在酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化效

6、率較高，每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)可達(dá)200個，但經(jīng)過多代培養(yǎng)后，子細(xì)胞中的拷貝數(shù)會迅速減少。整合型質(zhì)粒載體（yeastintegrationplasmid，YIP）整合型質(zhì)粒載體不含酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母中進(jìn)行自主復(fù)制，但含有整合介導(dǎo)區(qū)，可通過DNA的同源重組將外源基因整合到酵母染色體上，并隨染色體一起進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒與染色體DNA的同源重組主要有單交換整合和雙交換整合兩種方式。著絲粒型質(zhì)粒載體（yeastcentromericplasmid，YCP）該型質(zhì)粒載體是在自主復(fù)制型的基礎(chǔ)上，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件。在細(xì)胞分裂時，

7、質(zhì)粒載體能平均分配到子細(xì)胞中，穩(wěn)定性較高，但拷貝數(shù)很低，通常只有1～2個拷貝。該載體在酵母細(xì)胞中以線性雙鏈DNA的形式存在，每個細(xì)胞內(nèi)只有單拷貝，包含酵母染色體自主復(fù)制序列、著絲粒序列、端粒序列、酵母菌選擇標(biāo)記基因、大腸桿菌復(fù)制子和選擇標(biāo)記基因等。在細(xì)胞分裂和遺傳過程中，能將染色體載體均勻分配到子細(xì)胞中，并保持相對獨(dú)立和穩(wěn)定。酵母菌選擇標(biāo)記基因SUP4表達(dá)時轉(zhuǎn)化子菌落呈白色，不表達(dá)時呈紅色。外源基因的插入可滅活SUP4基因，獲得紅色的重組轉(zhuǎn)化子。YAC載體可插入200～800kb的外源基因片段，因而特別適合高等真核生物基因組的克隆與表達(dá)研究

8、。酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）酵母基因表達(dá)系統(tǒng)宿主菌主要包括釀酒酵母巴斯德畢赤酵母乳酸克魯維酵母多型漢森酵母釀酒酵母它具有作為宿主