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《黃河鯉Wnt4基因的克隆、表達(dá)模式分析和Wnt信號(hào)通路基因的結(jié)構(gòu)及功能分析.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、CLONING,EXPRESSIONANDFUNCTIONANALYSISOFWNT4ANDSTRUCTURE,FUNCTIONANALYSISOFGENESINWNTSIGNALINGPATHWAYINYELLOWRIVERCARPADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormaluniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByJiXiaolinSupervisor:Pr
2、of.DuQiyanMay,2016摘要Wnt4(wingless-typeMMTVintergrationsitefamily,member4)是Wnt基因家族成員之一，從無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物廣泛存在，參與多種生命活動(dòng)，并且在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)證實(shí)其在卵巢分化過程中有重要作用。本研究根據(jù)已經(jīng)得到的其它硬骨魚類的Wnt4基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RACE技術(shù)，得到了黃河鯉該基因的全長序列。結(jié)果表明，得到的序列中5'非翻譯區(qū)（5′-UTR）445bp，3'非翻譯區(qū)（3′-UTR）包含polyA尾共988bp，開放閱讀框1056bp，編碼35
3、2個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為39409.2道爾頓，理論等電點(diǎn)為8.61，共編碼20種氨基酸，帶有負(fù)電荷氨基殘基（天冬氨酸和谷氨酸）39個(gè)，帶有正電荷氨基殘基（精氨酸和賴氨酸）48個(gè)，有24個(gè)半胱氨酸殘基為Wnt基因家族所特有，有22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，有跨膜區(qū)，為分泌型蛋白。對(duì)黃河鯉WNT4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)α螺旋占比30.11%，β轉(zhuǎn)角占比9.94%，無規(guī)卷曲占比40.34%，延伸鏈占比19.6%。氨基酸序列在硬骨魚類中保守性較高，而與兩棲類、鳥類、哺乳類動(dòng)物間保守性較低。黃河鯉與同為鯉形目的模式生物斑馬魚該基因間的相似性達(dá)到
4、98.3%，在進(jìn)化上最接近。本研究用RT-PCR、qRT-PCR和原位雜交三種方法對(duì)該基因在胚胎發(fā)育時(shí)期、6月齡雌雄組織和成熟個(gè)體雌雄組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，相互進(jìn)行驗(yàn)證，最終三種方法結(jié)果一致。在胚胎發(fā)育時(shí)期都可以檢測到Wnt4基因的表達(dá)，總體呈現(xiàn)先上升后下降平穩(wěn)表達(dá)的趨勢(shì)，整體原位雜交結(jié)果顯示從原腸胚時(shí)期的內(nèi)胚層到孵化后的肝臟部位均有明顯陽性信號(hào)，在6月齡和成熟個(gè)體組織表達(dá)研究中也發(fā)現(xiàn)該基因在肝臟中表達(dá)量較高，同樣的結(jié)果在一些低等動(dòng)物中有證實(shí)，推測其可能對(duì)黃河鯉肝臟的發(fā)育和功能維持有重要作用。在卵巢中，黃河鯉Wnt4基因在成熟卵巢中的表
5、達(dá)要高于Ⅱ期發(fā)育中的卵巢，主要表達(dá)在卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與已有研究相似，推測黃河鯉Wnt4基因參與卵巢的發(fā)育和功能維持，并不參與早期的卵巢分化。在精巢中，可以看到黃河鯉成熟期精巢中Wnt4基因的表達(dá)量高于二期精巢，同時(shí)高于成熟期卵巢，該結(jié)果發(fā)現(xiàn)在精巢中的表達(dá)模式與多數(shù)哺乳動(dòng)物相比并不保守，但與一些硬骨魚類表達(dá)模式相似，推測其成熟雄性性腺中Wnt4基因的高表達(dá)可能是參與了雄性類固醇生成的延遲。綜上，該基因參與兩I性性腺的發(fā)育，并且在發(fā)育后期有重要作用。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)于哺乳動(dòng)物的性別決定和性別分化的作用已經(jīng)研究較為透徹，本研究利用化學(xué)
6、抑制劑IWR-1-endo處理未分化的黃河鯉個(gè)體，希望對(duì)該通路對(duì)黃河鯉性別決定和分化的作用得到一些驗(yàn)證。結(jié)果顯示，通過藥物抑制，在實(shí)驗(yàn)組中通路下游轉(zhuǎn)錄因子以及6個(gè)雌性標(biāo)志基因都出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)量下調(diào)，而對(duì)于4個(gè)雄性標(biāo)志基因的檢測結(jié)果并沒有統(tǒng)一性。綜上，我們?cè)趯?duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路進(jìn)行抑制后，發(fā)現(xiàn)了雌性基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)，推測其對(duì)于黃河鯉雌性性別發(fā)育有一定的作用，而其作用機(jī)制和對(duì)雄性性別發(fā)育的作用還有待進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞:黃河鯉，Wnt4，RACE，RT-PCR，原位雜交，Wnt信號(hào)通路IIABSTRACTWnt4(wingless
7、-typeMMTVintegrationsitefamily,member4)belongedtotheWntfamily,itwasfoundinbothinvertebratesandvertebrates,andinvolvedinmanyimportantprocesses.IthasbeenprovedthatWnt4genewasplayamajorroleinovariandifferentialinmammals.Inthisstudy,usingtheforwardandbackwardprimersdesignedo
8、nthebasisoftheconservedregionaminoacidsequenceoftheWnt4genesregisteredinGenbank.Weobtainedthefulllength
