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《基于基因組消減雜交技術(shù)的石刁柏性別差異重復(fù)序列的克隆與定位.pdf》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、CLONINGANDLOCALIZATIONOFSEXDIFFERENCEREPETITIVESEQUENCESFROMASPARAGUSOFFICINALISBASEDONGENOMICSUBTRACTIVEHYBRIDIZATIONADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLiZhongxiaSupervisor:Prof.GaoWujunMay,201
2、6摘要石刁柏(Asparagusofficinalis)又名蘆筍,是一種多年生雌雄異株草本植物,其單倍體基因組大小為1323Mbp,具有2n=2X=20條染色體,其性染色體組成為同型XY型性染色體,在性染色體演化仍處于早期階段,能更有利于進(jìn)行植物性染色體起源和演化機(jī)制的研究。目前研究表明,植物XY性染色體起源于一對(duì)常染色體,其中的一條由于某種未知原因而累積了反轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列而在體積上逐步擴(kuò)展,進(jìn)而從形態(tài)上逐漸演化為異型的XY性染色體。但是,重復(fù)序列的累積是否是性染色體體積擴(kuò)展的普遍現(xiàn)象,是否參與了性染色體早期的演化過程等問題仍不清楚。因此,本文以石刁柏為材料,利用基因組消減
3、雜交技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)分離分析雌雄基因組差異重復(fù)序列,并采用中期染色體熒光原位雜交技術(shù)對(duì)獲得的性別差異序列進(jìn)行染色體定位,分析重復(fù)序列在性染色體起源和演化過程中可能的作用。為揭示石刁柏性染色體起源及演化的機(jī)制提供理論資料。主要研究結(jié)果如下:1、以石刁柏雌雄基因組DNA為材料,利用通用引物M13對(duì)石刁柏6600個(gè)消減雜交克隆產(chǎn)物進(jìn)行篩選,通過斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證后獲得98個(gè)雌雄差異序列。對(duì)測(cè)序成功的52條序列分析發(fā)現(xiàn),所獲得的序列長度分布在63bp-297bp。其中,33個(gè)屬于非葉綠體基因組來源序列(命名為Ao1-Ao33),包括3個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子,15個(gè)未命名序列,6個(gè)mRNA序列,
4、9個(gè)其他序列。另外,19個(gè)序列屬于葉綠體來源序列(命名為Ao34-Ao52),Ao34-Ao50在核酸數(shù)據(jù)庫中均有同源序列,相似度分布在84%-100%,Ao51相似度最低為37%。Ao52序列在數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源序列,其序列與石刁柏葉綠體基因組相似性為100%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證52個(gè)序列是否為性別差異的序列,利用基因組半定量技術(shù)對(duì)52個(gè)斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證的差異序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明,其中9條差異序列為雌雄差異序列,包含5條為非葉綠體來源序列(分別為Ao6、Ao13、Ao15、Ao19、Ao29)。4條為葉綠體基因組來源序列(分別為Ao34、Ao36、Ao43、Ao51),序列定位發(fā)
5、現(xiàn)轉(zhuǎn)移到核基因組的核葉綠體序列(nuclearintegrantsofplastidDNA,NUPTs)主要分布在葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)(invertedrepeat,IR)(包含IRa和IRb區(qū))(分別為Ao34、Ao36、Ao43)。說明葉綠體反向重復(fù)區(qū)序列更容易向核基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)移,這可能和該區(qū)域序列高拷貝數(shù)有關(guān)。2、為了對(duì)所獲得的性別差異序列進(jìn)行染色體定位,將5條非葉綠體來源的差異序I列從基因組中進(jìn)行長片段擴(kuò)增。其中,Ao6和Ao15兩個(gè)序列成功獲得長度分別為3048bp和528bp的長序列(分別命名為Ao6-L和Ao15-L)。中期染色體熒光原位雜交結(jié)果表明,Ao6
6、-L序列在所有染色體著絲粒上有雜交信號(hào),且在著絲粒上的信號(hào)強(qiáng)烈而明顯。Ao15-L序列在所有染色體上均有雜交信號(hào),且信號(hào)集中在著絲粒及其附近,距離著絲粒越近信號(hào)越強(qiáng)。由此可以得出差異重復(fù)序列在著絲粒位置富集最多。石刁柏染色體著絲粒含有大量重復(fù)序列,才使雜交信號(hào)在著絲粒及其附近堆積。3、為了對(duì)所獲得的葉綠體來源的序列進(jìn)行染色體定位,首先根據(jù)石刁柏葉綠體基因組序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行長序列擴(kuò)增,其中,Ao52序列成功獲得長度為2859bp(命名為Ao52-L)。中期染色體定位發(fā)現(xiàn),Ao52-L序列在所有染色體上均有雜交信號(hào),且信號(hào)從端粒到著絲粒呈現(xiàn)逐漸加強(qiáng)的特征,說明該NUPTs序列在著
7、絲粒位置富集最多,這和水稻中期染色體NUPTs的分布特征相一致。其次,著絲粒位置本身存在較多重復(fù)序列,也進(jìn)一步說明了從葉綠體轉(zhuǎn)移到核基因組的序列也是組成著絲粒側(cè)翼重復(fù)序列的重要成分之一。石刁柏葉綠體序列在核基因組中的插入,刪除,以及重排是在新型核基因的產(chǎn)生的重要進(jìn)化過程。關(guān)鍵詞:石刁柏;性別差異重復(fù)序列;NUPTs;性染色體演化;基因組消減雜交IIABSTRACTAsparagusofficinalisisanimportantperennialdioeciousherb,itshaploidgenom