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1、RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用生工1002李奔存TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006安德魯·法爾AndrewZ.Fire美國(guó) 美國(guó)麻省理工學(xué)院1959～雷格·梅洛CraigC.Mello美國(guó) 哈佛大學(xué)1960～FortherediscoveryofRNAinterference-genesilencingbydouble-strandedRNARNAi（RNAinterference，RNA干擾）Double-strandedRNAinhibitsexpressionofgenes
2、homologoustothatRNA.雙鏈RNA抑制含其同源序列基因的表達(dá)BriefHistoryofRNAiDiscoveries1990年，RichJorgensen設(shè)想，在矮牽牛中花插入一種催生紅色素的基因，能使花朵的色彩更艷麗，而結(jié)果出其預(yù)料，轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒(méi)有新基因表達(dá)，反而使原有的色素基因也受到了抑制，花的顏色變?yōu)榘咨?，?dāng)時(shí)稱共抑制（cosuppression)95年Guo和kemphues在秀麗線蟲(chóng)(C.elegans)中用反義RNA阻止一些基因的表達(dá)，給對(duì)照組用正義RNA不但不增加該基因的表達(dá)，
3、反而產(chǎn)生與反義RNA同樣的結(jié)果——特異性阻斷該基因的表達(dá)，從而正式表明RNA干擾現(xiàn)象的存在。94年Cogoni等證明真菌中亦有類(lèi)似現(xiàn)象，此稱為基因壓制(quelling)。1998年AndrewFire等首次將正義鏈反義鏈RNA混合注入線C.elegans中，觀察到更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制。首次提出了RNAinterference的概念A(yù)control:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNA2001年Elbashir等《Nature》上首次報(bào)道通過(guò)21個(gè)核苷酸的siRNA成功的
4、在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。三.RNAi作用機(jī)制起始階段效應(yīng)階段擴(kuò)增擴(kuò)散階段起始階段病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA這些dsRNA被胞質(zhì)中的RNaseⅢ特異核酸酶Dicer切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNAsiRNA的特點(diǎn)：3’端均有2～3個(gè)突出的核苷酸siRNA雙鏈結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC）效應(yīng)階段
5、在ATP存在情況下，siRNA雙鏈展開(kāi)激活RISC，激活的RISC即可通過(guò)堿基互補(bǔ)與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA。依次循環(huán)：新合成的長(zhǎng)鏈ds
6、RNA同樣可被Dicer切割、降解生成大量的次級(jí)siRNA。次級(jí)siRNA又可進(jìn)入合成一切割的循環(huán)過(guò)程，進(jìn)一步放大RNAi作用。擴(kuò)增擴(kuò)散階段四、RNAi研究的一般技術(shù)路線確定目的基因設(shè)計(jì)siRNA的序列獲得siRNA產(chǎn)物siRNA轉(zhuǎn)染RNAi效果檢測(cè)化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段RNA消化siRNA表達(dá)載體siRNA表達(dá)框架1.siRNA的一般結(jié)構(gòu)：哺乳動(dòng)物：21-23bpdsRNA其它生物：更長(zhǎng)的片段dTdT（UU）（UU）dTdT四siRNA的設(shè)計(jì)2.設(shè)計(jì)流程（選擇siRNA靶位點(diǎn)）從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開(kāi)始，搜尋下
7、游AA序列，記錄跟每個(gè)AA3’端相鄰的19個(gè)核苷酸作為候選的siRNA靶位點(diǎn)；根據(jù)5‘和3’非翻譯區(qū)（UTR)及靠近起始密碼子（75個(gè)堿基之內(nèi)）等富含調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)siRNA。將候選靶位點(diǎn)與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比較，去掉哪些與其它編碼序列同源的靶序列。設(shè)計(jì)陰性對(duì)照：陰性對(duì)照siRNA應(yīng)與siRNA的核苷酸組成相同但沒(méi)有與基因組明顯同源的序列。一般通過(guò)改變siRNA核苷酸順序并經(jīng)同源序列比較確證而得。獲得siRNA產(chǎn)物1、化學(xué)合成盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。許
8、多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對(duì)siRNAs的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究；不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要
