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1、甲霜靈膠體金競爭法試紙條的研制2005.12.8一、前言農(nóng)藥甲霜靈簡介最高殘留限量標準檢測方法的建立分課題進展情況簡單匯報1.農(nóng)藥甲霜靈簡介農(nóng)藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米爾、瑞毒霉、甲霜安，化學(xué)名稱D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，屬酰苯胺類殺菌劑。據(jù)中國農(nóng)藥毒性分級標準，屬低毒殺菌劑。對卵菌引起的病害具有獨特的保護和治療作用。2.最大殘留限量標準聯(lián)合國FAO/WHO食品法委員會（CCPR）《關(guān)于食品和飼料中農(nóng)藥最高殘留限量的規(guī)定》中
2、規(guī)定每日允許攝入量（ADI）為0.03mg/kg體重，禾谷類植物最高允許殘留量為0.05×10-6。中華人民共和國衛(wèi)生部和中國國家標準化管理委員會于2005年1月25日發(fā)布，自2005年10月1日起實施中華人民共和國國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量標準（GB2763-2005），該標準中規(guī)定了農(nóng)藥甲霜靈在食品中的最大允許殘留量。中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量標準種類最高殘留限量（MRL），≤，mg/kg國家標準號谷子0.05GB2763-2005黃瓜0.5GB2763-2005葡
3、萄1GB2763-20053.檢測方法建立甲霜靈不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的氣相色譜法檢測困難。Krause在原有檢測基礎(chǔ)上進行改進，將高效液相色譜法（HPLC）應(yīng)用于食物樣本檢測中，此方法普遍用于檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑。雖然HPLC法具有更高的靈敏度，可以精確地對樣品中的農(nóng)藥進行定性和定量分析，但此法要求精密復(fù)雜的儀器，而且需要專業(yè)人員操作，不適合于大批量樣品的檢測。膠體金免疫層析診斷技術(shù)是在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體金顯色技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)，具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、
4、無需專業(yè)人員操作等特點，真正達到復(fù)雜原理與簡易操作的統(tǒng)一；同時具有保存方便，有效期長等特點。與氣相色譜法補充使用，具有靈敏度高、操作簡便、檢測迅速等特點。主要技術(shù)路線4.分課題情況簡單匯報擬解決的關(guān)鍵技術(shù)：小分子免疫原的合成、與小分子免疫原抗原決定簇配對單克隆抗體的制備及膠體金研究。課題完成情況及效果：本課題已成功研制出合成免疫原N2B，進行免疫獲得單克隆抗體N2B14E6C10,這一針對甲霜靈抗原決定簇配對的單克隆抗體，親和力好，效價達到10-9，并成功制成甲霜靈膠體金檢測試紙，應(yīng)用競爭法膠體
5、金檢測試紙最低檢出量可達0.3mg/kg，達到國標要求。通過比對試驗的驗證，相關(guān)系數(shù)r=0.99996，說明方法的可靠性。因此，可以肯定膠體金免疫法在農(nóng)藥、獸藥殘留限量快速檢測技術(shù)中，是最有效、最快速、最簡便的方法。其優(yōu)點在于靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、常溫儲存等，是適合于現(xiàn)場檢測的一種快速檢測方法，是食品安全檢測的一種手段，互補現(xiàn)有檢測方法各自的優(yōu)缺點。二、試驗研究內(nèi)容免疫原合成抗體制備膠體金研究半成品研制及鑒定成品研制1.免疫原合成半抗原合成免疫原合成免疫原的鑒定小結(jié)（1）半抗原合成
6、將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，并加入10.056g甲霜靈，油浴50℃下攪拌6h，用TLC檢測，反應(yīng)完全；用乙酸乙酯洗滌反應(yīng)液，棄去酯相；水層用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0左右，析出白色物質(zhì)；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用無水硫酸鈉干燥過夜；抽濾酯相，旋轉(zhuǎn)蒸除溶劑，得到白色固體物質(zhì)；用正己烷和乙酸乙酯重結(jié)晶，抽濾后得到半抗原N2（甲霜靈酸）。（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶解，加入0.258gDCC和0.125gNHS；用TLC監(jiān)測反應(yīng)完全程度，待反應(yīng)完全后，抽濾
7、反應(yīng)液，用DMF洗滌兩遍；稱取2gBSA，用200mL0.2mol/LpH值8.7的硼酸鹽緩沖液溶解；將DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室溫攪拌過夜，得到甲霜靈免疫原N2B。先用蒸餾水透析2天，再用生理鹽水透析3天，每天換液2次；透析后的溶液于3000r/min離心15min，取上清液于-20℃下冷凍干燥，凍干后分裝保存。同法可將甲霜靈酸連接到雞卵清蛋白OVA上，合成檢測原（N2A）。（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在274.5nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.209ABS
8、；BSA在278.0nm出現(xiàn)最大吸收峰，峰值為0.083ABS。甲霜靈人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明顯高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通過紫外掃描可以證明，甲霜靈半抗原成功的連接到了載體蛋白BSA上。瓊脂糖雙擴散法鑒定DADT結(jié)果顯示，抗血清與免疫原（N2B）、BSA、檢測原（N2A）均出現(xiàn)反應(yīng)沉淀線，而與OVA、甲霜靈未產(chǎn)生可見的沉淀線。這說明抗血清中含有甲霜靈抗體和BSA抗體，不與OVA交叉反應(yīng)，雖然與甲霜靈發(fā)生交叉反應(yīng)（理論上推測），但不形成可見的沉淀線。DAD
