細(xì)胞化學(xué)染色ppt課件.ppt

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1、細(xì)胞化學(xué)染色實驗1一、過氧化物酶(PeroxidaseStain，POX)染色【目的和原理】細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶能將底物的過氧化氫分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧。后者將試劑中的聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍(lán)，后者與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合，進(jìn)而形成棕色化合物沉淀于酶的所在部位。2【器材和試劑】1．第一液聯(lián)苯胺0．3g360g／L亞硝基鐵氰化鈉飽和液lml95％L醇加至lOOml貯存于棕色瓶中，可保存一年。小瓶分裝備用。2．第二液(稀過氧化氫液，新鮮配制)3％過氧化氫0．3ml蒸餾水25ml3【步驟和方法】1．于新鮮干燥血涂片或骨髓涂片上

2、，滴加第一液5--8滴，使蓋滿整個血膜，作用1--2min.2．滴加等量的第二液，混勻，染4--8min。3．勿傾去染液，直接用水沖洗。4．干燥后再用瑞氏染液復(fù)染。4【結(jié)果】在細(xì)胞的胞漿中出現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)棕色顆粒為陽性反應(yīng)。1．陽性反應(yīng)強度的判斷：陰性：無顆粒。弱陽性：顆粒小，分布稀疏。陽性：顆粒略粗，分布較密集。強陽性：顆粒粗大，密布于整個胞質(zhì)中。52．粒細(xì)胞系統(tǒng)：早期原始粒細(xì)胞陰性，晚期(分化好)原始粒細(xì)胞以下各階段呈陽性，粒細(xì)胞越成熟POX反應(yīng)越強。但衰老的中性粒細(xì)胞酶活性降低，反應(yīng)程度減弱，甚至呈陰性反

3、應(yīng)。嗜酸性粒細(xì)胞顆粒更粗大，呈深藍(lán)色，嗜堿性粒細(xì)胞陰性。63．單核細(xì)胞系統(tǒng)：除早期原始階段外皆呈弱陽性反應(yīng)。其顆粒細(xì)小，彌散分布，可覆蓋核上，有的也可呈陰性反應(yīng)。4．正常網(wǎng)狀細(xì)胞(分化型)及吞噬細(xì)胞：可呈不同程度陽性反應(yīng)。5．淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞系統(tǒng)等：均為陰性。6．Auer小體：呈陽性。789【臨床意義】POX染色是鑒別急性粒細(xì)胞白血病(簡稱急粒)、急性單核細(xì)胞白血病(簡稱急單)、急性淋巴細(xì)胞白血病(簡稱急淋)類型的重要細(xì)胞化學(xué)方法。101．急性粒細(xì)胞白血?。杭?xì)胞分化較好時，原始粒細(xì)胞呈陽性

4、反應(yīng)，陽性率可>30%，在分化較差的白血病，如AML-M0和未分化型（AML-M1）的部分病例，原粒細(xì)胞的POX染色也可呈陰性。2．急性早幼粒細(xì)胞白血病時白血病細(xì)胞呈強陽性反應(yīng)。113．急性淋巴細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，F(xiàn)AB分型規(guī)定POX陽性率<3％。4．急性粒單細(xì)胞白血?。涸技?xì)胞POX染色多呈陽性，陽性率一般>20%，但難于區(qū)分原粒和原單時可進(jìn)一步作酯酶染色鑒別。125、急性單核細(xì)胞白血?。涸瓎魏陀讍蜳OX多呈弱陽性或陰性，單核細(xì)胞呈弱陽性，陽性率常>3%，陽性顆粒較為細(xì)小、稀疏。136、中性粒細(xì)胞髓過氧化酶缺

5、陷癥：中性粒細(xì)胞POX染色，純合子呈陰性，雜合子多為弱陽性。在一些髓系細(xì)胞白血病，如部分慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）患者，中性粒細(xì)胞POX染色可呈陰性或弱陽性，提示POX獲得性缺陷。14【注意事項】1．過氧化氫必須新鮮配制。過氧化氫的最適濃度是0．05mol／L左右，濃度過高，反而抑制酶作用。一般采用5ml蒸餾水，加3％過氧化氫一滴。若用30％的過氧化氫時，只能在100ml蒸餾水中加1～2滴。涂片中粒細(xì)胞看不見陽性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。152.染

6、色時稀釋過氧化氫之后必須與聯(lián)苯胺液充分混合，否則同一涂片細(xì)胞染色情況不一致。16【評價】POX染色是鑒別急性白血病類型最常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法。但若原始細(xì)胞均呈陰性（陽性率<3％），并不能肯定是急性淋巴細(xì)胞白血病，因為分化較差的白血病性原粒細(xì)胞、原單細(xì)胞、原巨核細(xì)胞、原淋巴細(xì)胞均可呈陰性，此時應(yīng)結(jié)合其他細(xì)胞化學(xué)染色、細(xì)胞免疫表型分析等進(jìn)行鑒別。17二、鐵染色(IronStain)【目的和原理】骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細(xì)胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶

7、液中產(chǎn)生普魯士藍(lán)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。18【材料】1.酸性亞鐵氰化鉀溶液取200g／L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩滴加濃鹽酸，邊滴邊搖勻，至出現(xiàn)白色沉淀，再滴加200g／L亞鐵氰化鉀溶液，亦邊滴邊搖勻，至白色沉淀消失為止，備用。2．2g／L核固紅-硫酸鋁溶液取硫酸鋁2g溶于100ml蒸餾水中，再加入核固紅(Emerk出品)0.2g。置37℃水浴中1h并隨時振蕩，使溶解，過濾后使用。19【步驟和方法】1.選骨髓小粒豐富的骨髓片，用甲醇固定10min，待干。2．玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀，染色30min

8、(可置37℃環(huán)境)3.用蒸餾水沖洗后用核固紅染液復(fù)染10—15min。4．流水沖洗、待干、鏡檢。20【結(jié)果】(1)幼紅細(xì)胞核呈鮮紅色，漿呈淡黃紅色，鐵粒呈藍(lán)綠色。(2)細(xì)胞外鐵：用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍(lán)色顆粒的存在，可分五級標(biāo)準(zhǔn)。21(-)：無顆粒(+)：有少數(shù)鐵顆粒或偶見鐵小珠(顆粒體積大于嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒者稱為鐵珠)。(++)：有較多的鐵顆粒和小珠。(+++)：有很多的鐵顆粒、小