人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立.docx

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1、人胃腺癌裸鼠移植瘤模型的建立動(dòng)物：BALB／c(nu／nu)裸小鼠，鼠齡6～10周，體重l5～25g，雄性。飼養(yǎng)在無特殊致病菌、空氣潔凈的凈化工作臺(tái)內(nèi)，室內(nèi)恒溫、恒濕，定期消毒?；\具、墊料、飼料和飲水均經(jīng)高壓蒸氣滅菌，并在無菌條件下適時(shí)更換。方法：收集培養(yǎng)的BGC-823細(xì)胞(癌細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。)在細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)，用RPMI-1640制成約2×l07個(gè)／ml細(xì)胞懸液，取0．2ml(4x106個(gè)BGC-823細(xì)胞/只)注入裸小鼠頸部皮下或者背部皮下，每組接種3只鼠，當(dāng)皮下移植

2、瘤長至直徑為lcm3左右時(shí)取出移腫瘤（大約在10d左右），及時(shí)放入含無血清培養(yǎng)液的平皿中，A再在超凈工作臺(tái)內(nèi)修剪腫瘤組織，去除脂肪，結(jié)締組織及壞死腫瘤組織，并用無血清培養(yǎng)液洗滌2次，將瘤組織切成約lmm×lmm×2mm的小塊，加入適量的pbs備用。以戊巴比妥經(jīng)腹腔注射麻醉裸鼠，常規(guī)消毒背部肩胛區(qū)，（切開局部皮膚）用無菌套管針抽吸準(zhǔn)備好的2mm3大小瘤塊，將其接種于裸鼠背部肩胛區(qū)皮下，建立祼鼠皮下移植的人體胃癌祼鼠模型。作鼠間傳代(2只／代)。移植瘤生長特性：胃癌細(xì)胞接種后的第三天即可見到裸鼠接種處皮下出現(xiàn)結(jié)節(jié)，直徑約1．5mm，質(zhì)地較硬，在以后的幾

3、天中，上述皮下結(jié)節(jié)沒有繼續(xù)增大，此階段為腫瘤細(xì)胞生長的潛伏期(7-10d左右)。隨后，裸鼠皮下的腫瘤結(jié)節(jié)開始緩慢生長．體積逐漸增大。大概(25-30d)傳代后荷瘤鼠皮下移植瘤的生長情況與初代移植瘤相近。A具體操作：　1一般要求　　需在無菌條件下進(jìn)行?？稍诮臃N罩、超凈工作臺(tái)或無菌室內(nèi)操作。動(dòng)物處死后，用新吉爾滅(1∶1000)或碘酊、酒精消毒，對每個(gè)實(shí)體瘤應(yīng)分別用滅菌的外科器械切取，對腹水瘤則應(yīng)分別用滅菌的空針抽吸。瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應(yīng)予注意在高溫季節(jié)操作時(shí)，應(yīng)注意降溫，可在盛有瘤源的器皿周圍放置冰塊?！　〕Ｓ靡赶虏课黄は伦鳛閷?shí)體瘤接種

4、部位；肌肉接種則用大腿肌肉；腹水型接種于腹腔。2　瘤塊的制備　　接種用的瘤塊應(yīng)選擇接種后7－10d、腫瘤生長旺盛且無潰破而動(dòng)物健康較好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼，固定于蠟板上，用碘酊及酒精消毒操作部位皮膚(消毒面應(yīng)盡可能大一些)。切開皮膚、選擇生長良好無壞死或液化的瘤組織。在無菌平皿內(nèi)，剪成2－3mm3的小塊。平皿內(nèi)放置少許消毒的生理鹽水緩沖液或其它營養(yǎng)液，以保存瘤塊。平皿應(yīng)放置在冰塊上。用無菌套管針抽吸或向套管針內(nèi)塞進(jìn)一小瘤塊，接種于同種受體動(dòng)物右前肢腋窩皮下(接種部位皮膚應(yīng)先用碘酊、酒精消毒)。接種操作時(shí)間應(yīng)盡可能的縮短，從一個(gè)瘤塊所取的材料一般應(yīng)在

5、30min內(nèi)接種完。3　瘤細(xì)胞懸液的制備　　如每次需要接種的動(dòng)物數(shù)量較多時(shí)，可用瘤細(xì)胞懸液接種。具體方法為，在無菌操作下取瘤塊，除去壞死組織，將數(shù)個(gè)瘤塊混合，剪成小塊，用玻璃組織勻漿器研磨，磨勻后放入無菌容器內(nèi)，加生理鹽水適量稀釋成1∶3－1∶4的瘤細(xì)胞懸液。容器置冰塊上，用空針抽吸，每次抽吸前應(yīng)將細(xì)胞混勻。每個(gè)動(dòng)物接種0.2mL。整個(gè)操作應(yīng)在30min內(nèi)完成?！　⊥Ｖ菇o予受試物之次日(或停止給予受試物后1－5d)處死動(dòng)物，先稱體重，后解剖皮下瘤塊，稱重。如對照組小白鼠腫瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400mg，大白鼠腫瘤平均重量小于2g，

6、表示腫瘤生長不良。在試驗(yàn)期間給受試物組鼠死亡超過20%，或平均體重(去瘤后)下降(自身對照)超過15%者，表示受試物的毒性反應(yīng)。應(yīng)當(dāng)減少劑量重新試驗(yàn)。取平衡飼養(yǎng)1周的BALB/C裸鼠若干只，于第3d將瘤細(xì)胞懸液按0.5ml/只(含瘤細(xì)胞7.5X10e個(gè))接種于BALB/C裸鼠左側(cè)肋部皮下。BGC823單細(xì)胞懸液的制備：將BGC823細(xì)胞，用RPMI一1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基(PH7.2，含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)，于37度，5%C02，飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3d傳代一次。該細(xì)胞貼壁生長，呈多角形。實(shí)驗(yàn)時(shí)取

7、對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，1500rpm離心smin，棄上清液，用適量PBS配制成細(xì)胞濃度分別為1.5x1)/ml懸液，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色法測細(xì)胞活力在95%以上。18號(hào)的硬脊膜外穿刺針，把外面的套管針部分磨平磨尖（為什么要磨，看到實(shí)物你就明白了），里面的實(shí)體針不用磨。一次用6根左右就可以了，先用一個(gè)不銹鋼飯盒之類的東西作一個(gè)手術(shù)包，把所有相關(guān)的手術(shù)器械（剪刀鑷子什么的，包括接種針）都裝進(jìn)去，蓋上蓋子，8層紗布包裹，121度，半個(gè)小時(shí)。操作的時(shí)候在超凈臺(tái)里面進(jìn)行無菌操作，接種針一字排開，一個(gè)塞個(gè)5、6根，然后一

8、起接種，一輪完了以后繼續(xù)塞，不用消毒處理，但是接種的時(shí)候要保證無菌操作，如果接種針碰到什么非無菌的地方，這根針這次就不能接