污染湖泊宏基因組文庫中谷氨酸脫羧酶基因的克隆及功能研究.pdf

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1、碩女単位論文污染湖泊宏基因組文庫中谷氨酸脫幾酶基因的克隆及功能研究唐銘澤Ｉ．：＼ｉ＇——一戶：、？又二〇五年六月．戈迫巧．巧去品，：‘＇：詰灘議茍；過編繁鎮(zhèn)讓纖觀鐵１４；．占帶曲祉：桿姆嘴城：巧話石沾識扣去肚雑驗(yàn)誠穩(wěn)議纖鐵攀＾．Ｖ與ｆ‘＾：請；皆沖也Ｖ；：祐卻靖記磚皆巧．＇寺’．分類號０７８１密綴公開ＵＤＣ碩±學(xué)位論文巧染湖泊宏基因組文庫中谷氨酸脫綾酶基因的克隆及功能研究唐銘澤學(xué)科專業(yè)微生物學(xué)指導(dǎo)教師蔣承建教授２０１５．．論文答辯日期．０５．２８學(xué)位授予日期２０１５６３

2、０答辯委員會主節(jié)梁靜娟教授廣西大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明本人聲明所呈交的論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除已特別加Ｗ標(biāo)注和致謝的地方外，論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大學(xué)或其它單位的學(xué)位而使用過的材料一。與我同工作的同事對本論文的研究工作所做的貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確說明。本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬廣西大學(xué)。本人授權(quán)廣西大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，目日：學(xué)校有權(quán)保存并向國家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論

3、文被查閱和借閱，可Ｗ將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和傳播，可Ｗ采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于：□保在年解密后適用授權(quán)。＾跡＾密。＂＂（請?jiān)冢保奚舷鄳?yīng)方框內(nèi)打＞／）＾確論文作者簽名Ｉ巧Ｗ：惠終日期：如指導(dǎo)教師簽名：日期：又？／護(hù)＾皮作者聯(lián)系電話：電子郵箱；污染湖泊宏基因組文庫中谷氨酸脫轅酶基因的克隆及功能研究摘要－ＡＢＡ氨基下酸（Ｇ）是哺乳動物的重要神經(jīng)遞質(zhì)。Ｙ，具有多種保健功能谷氨酸脫簇酶在催化谷氨酸脫去簇基后，可生成ＧＡＢＡ。相對于化學(xué)合成法而言－，利用微生物技術(shù)生

4、產(chǎn)Ｙ氨基了酸具有不可比擬的優(yōu)越性。未培養(yǎng)微生物中含有大量的新基因資源，而普通的分離純化Ｗ及純培養(yǎng)技術(shù)很難將其加Ｗ利用。因此，本課題探究了通過建立宏基因組文庫的辦法，挖掘自然界中新的谷氨酸脫簇酶基因，這在國內(nèi)外谷氨酸脫幾酶的研究中鮮有報道。ＧＥＭ－３Ｚｆ＋本課題利用酸性污染的環(huán)境樣品構(gòu)建了ｐ為載體，（）’’拉ｃＡｅＷｃ／Ｋａｃｏ／ｚＤＨ５ａ為宿主的宏基因組文庫，其中總共包含１．２萬個陽性ｅｎＢａｎｋ一克隆，容量約為５０．４Ｍｂ。通過隨機(jī)測序并與Ｇ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行致性比對一，發(fā)現(xiàn)該文庫中包含大量與參考序列致性較低的新基因，證明了這一方法的有效性。

5、通過活性篩選策略，最終從文庫中篩選得到了兩個具有明顯變色反應(yīng)的陽性克隆，命名為ｐＧＥＭＷｌ和ＰＧＥＭＷ２。將這兩個陽性克隆中所包含的０ＲＦ與Ｇ一一ｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行致性比對和功能鑒定，最終獲得了個編ａ妨。該基因全長約１．４化編碼碼谷氨酸脫簇酶的新基因，將其命名為ｇ，一４６９個５３條由氨基酸組成ｋＤａ，理論等電點(diǎn)為５．６１的，分子量約為多膚鏈。在氨基酸水平上，它與心？Ｃ化細(xì)ｉｔｏｎｚ／ｗ屬編碼的谷氨酸脫簇酶％的一具有９９致性，但該基因來自于全基因組注釋，并沒有進(jìn)行功能鑒定。Ｉ將ｇｏ奶基因表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎮(zhèn)柱純化后，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定，

6、‘２＋２＋２＋２＋２＋發(fā)現(xiàn)其最適濕度為３７Ｃ，最適ｐＨ值為４．７，Ｓｒ，Ｃｏ，Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｇ２＋３３＋２＋２＋和Ｚｎ對酶促反應(yīng)有明顯的激活作用，Ａ１＼Ｆｅ、Ｍｉｉ和Ｃｕ對酶促反應(yīng)。ＥＤＴＡ有明顯的抑制作用對酶活有明顯的抑制作用，說明該酶對金屬離子二－具有依賴性．６１９ｍ／ｍＬ，ｋ／１９．４８３ｍＬ／ｍｓ。。純酶的值為０ｇｃａｔ＆ｎ（ｇ）與其他來源的谷氨酸脫簇酶相比較，該酶的性質(zhì)參數(shù)處于中等水平。本研究建立了一整套利用宏基因組文庫技術(shù)克隆得到新的谷氨酸脫綾酶基因的方法一，對于后續(xù)研究具有定的借鑒意義。關(guān)鍵詞：宏基因組文庫技術(shù)谷氨酸脫撥

7、酶大腸巧菌表達(dá)系統(tǒng)功能鑒定活性篩選ＩＩＧＥＮＥＣＬＯＮＩＮＧＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦＡ以ＧＬＵＴＡＭＩＣＡＣＩＤＤＥＣＡＲＢＯＸＹＬＡＳＥ＂妨ＦＲＯＭｇＣＯＮＴＡＭＩＮＡＴＥＤＬＡＫＥＭＥＴＡＧＥＮＯＭＥＡＢＳＴＲＡＣＴＧａｍｍａａｍｉｎｏａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）ｉｓ泣ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｅｒｉｎｍａｍｍａｌｓ，ａｎｄｉｔｈａｓｔｈｅ扣ｎｃｔｉｏ打ｏｆｉｎ