《血清蛋白電泳》PPT課件.ppt

《《血清蛋白電泳》PPT課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、血清蛋白電泳(SerumProteinElectrophoresis)血清和血漿血清:是指離體的血液經(jīng)過自然凝固而析出的液體部分.血漿:是指離體并經(jīng)過抗凝的血液經(jīng)過離心沉淀后的上清部分.血清中無纖維蛋白原簡介人類血液中有125種以上蛋白質(zhì)成分。白蛋白、脂蛋白、抗體、補體、凝血酶原和凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其他微量蛋白等成分。歷史1809年，Pehce(俄國物理學(xué)家)首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年，Tiselius(瑞典)制成界面電泳儀，應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究1948年，

2、Wieland和Fischer建立了濾紙電泳法，奠定了區(qū)帶電泳技術(shù)的基礎(chǔ)1959年，Raymond和Weintraub創(chuàng)建聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳和電泳技術(shù)電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。應(yīng)用電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外,最主要用于蛋白質(zhì),核酸等生物分子的研究.由于電泳法設(shè)備簡單,操作方便,具有高分辨率及選擇性特點,已成為醫(yī)學(xué)檢驗中常用的技術(shù).COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲

3、+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH

4、、吸附作用等電滲液體對固體支持物的相對移動，由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起。如果電滲與電泳方向相同，V變大；反之變小。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳原理在pH8.6堿性環(huán)境，血清蛋白均帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動各種蛋白質(zhì)pI不同，帶電荷量有差異蛋白質(zhì)的分子大小與分子形狀不相同帶電荷多、分子量小者，泳動較快；反之則較慢蛋白質(zhì)的等電點、分子量及遷移率蛋白質(zhì)名稱等電點相對分子量電泳遷移率白蛋白4.846.9萬5.9*10-5α1-球蛋白5.0620萬5.1*10-5α2-球蛋白5.0630

5、萬4.1*10-5β-球蛋白5.129萬～15萬2.8*10-5γ-球蛋白6.86～7.3015.6萬～30萬1.0*10-5電泳結(jié)果示意圖γβα2α1清蛋白染色時染料與蛋白質(zhì)特異結(jié)合而不與醋纖膜結(jié)合，染色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比染色一段時間后脫色，將各蛋白區(qū)帶剪下，經(jīng)脫色、比色即可計算出各蛋白質(zhì)組分的相對百分?jǐn)?shù)。如同時測定出總蛋白濃度，還可計算出各蛋白組分的絕對濃度正常血清電泳掃描圖譜試劑緩沖液：巴比妥緩沖液（pH8.6）染色液：麗春紅S染色液漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液洗脫液：0.1mol/LNaOH溶液操作

6、準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備CAM的準(zhǔn)備點樣吸3-5μl血清均勻點于CAM無光澤面電泳無光澤面朝下，點樣側(cè)置于負(fù)極端，通電染色將薄膜條浸入麗春紅S染色液，染5-10min漂洗醋纖膜規(guī)格及點樣示意圖定量取試管6支，在白蛋白管內(nèi)加入0.1mol/LNaOH液6ml，其余各管加入3ml，將各蛋白區(qū)帶剪下分別置于各試管中，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，37℃10-20min向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加0.3ml,以中和部分NaOH用520nm比色，以空白管調(diào)零，讀各管吸光度計算設(shè)各部吸光度分別為AA

7、、Aa1、Aa2、Aβ、Aγ。吸光度總和（AT）為：AT=AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ白蛋白（%）＝（AA*2AT）*100%a1-球蛋白（%）=（Aa1AT）*100%……注意事項通電時，不得接觸槽內(nèi)緩沖液或CAM，以防觸電緩沖液液面要保證一定高度標(biāo)本：血清應(yīng)新鮮，不得溶血染料：對蛋白質(zhì)的各組分親和力相同，水溶性好，穩(wěn)定，吸光度敏感，形成的染料蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定且易洗脫比色注意事項電泳后區(qū)帶拖尾、各區(qū)帶分開不明顯原因：點樣過多點樣不均勻、不整齊樣品觸及薄膜邊緣；薄膜過濕，樣品擴(kuò)散；薄膜未完全浸透或溫度過高導(dǎo)致

8、干燥或水分蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行緩沖液變質(zhì)；樣品不新鮮CAM質(zhì)量不高等電滲現(xiàn)象評價優(yōu)點：CAM電泳具有靈敏度高，標(biāo)本用量少，分辨率高，區(qū)帶清晰，電泳時間短，操作簡便快捷；CAM對染料不吸附，蛋白區(qū)帶均勻，背景清晰，既易比色定量，又易透明后進(jìn)行光密度掃描。缺點：有輕微電滲現(xiàn)象，薄膜吸水性差，電阻容易增大，當(dāng)電流較大時，薄膜中水分極易蒸發(fā)