血清蛋白電泳-醋纖電泳圓盤電泳ppt課件.ppt

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1、實驗二血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)即是利用樣品中各種帶電粒子的帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品分子進(jìn)行分離、鑒定、純化和制備。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)多用于分離，純化、鑒定蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。一、電泳技術(shù)電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強(qiáng)度內(nèi)粒子運動的速度，以u表示，即V—粒子運動的速度X—電場強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度影響電泳速度的因素1、影響電泳遷移率的外界因素：電場強(qiáng)度溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象2.影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：樣品所帶凈電荷的量樣品的大小和形狀

2、掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義二、實驗?zāi)康谋緦嶒炇且源姿崂w維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。方法是將少量新鮮血清用點樣器點在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。三、實驗原理經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白

3、，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。γβα2α1清蛋白人血清蛋白質(zhì)的等電點及分子量1.實驗材料：未溶血的人血清2.實驗試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.5％染色液漂洗液透明液3.實驗器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀鑷子點樣器玻棒粗濾紙培養(yǎng)皿吸量管直尺及鉛筆四、試劑及器材1.準(zhǔn)備醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理：將薄膜小心放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使其漂浮在液面；用鑷子輕壓，使其全部浸入緩沖液內(nèi)。待膜完全浸透（約半小時）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時分辨出光滑面和粗糙面。標(biāo)記：在粗糙面上用鉛筆距薄膜條一端1.5cm處劃線即為點樣線并作好標(biāo)記。五、試驗方法電泳槽

4、的準(zhǔn)備電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁減尺寸合適的率紙條，放入電泳槽，待濾紙條濕潤后，用玻璃棒擠壓排氣，使濾紙緊貼膜支架。2.點樣（關(guān)鍵）取出浸透的薄膜，平放在濾紙上(無光澤面向上)，用濾紙輕輕吸去多余的緩沖液，薄膜的粗糙面向上平放在點樣模板上，底邊對齊，點樣區(qū)距負(fù)極1.5cm。點樣時，用磨光的玻片蘸取血清后，均勻的涂抹在點樣區(qū)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。（見圖）注意：點樣時動作要輕、穩(wěn)，用

5、力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。另外操作過程要防止指紋污染。3.電泳將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂，使膜平衡10min。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.3mA/cm膜寬度。通電10min-15min后，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.5mA/cm膜寬度，電泳時間50min。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。點樣端1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板4.染色電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min

6、。5.漂洗用漂洗液漂洗，不停擺動薄膜條，每10min左右換一次液，連續(xù)更換數(shù)次，直至背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。6.記錄和分析實驗結(jié)果漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進(jìn)行描述、記錄在實驗本上，并判斷分析其結(jié)果。??清蛋白?1?2??1、洗脫法：剪下各蛋白區(qū)帶0.02mol/LNaOH洗脫將洗脫液用分光光度計比色結(jié)果計算每種蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)量的相對含量=該種蛋白管光密度讀數(shù)各管光密度讀數(shù)之和×100%六、各蛋白組分的定量2、光密度計掃描法??清蛋白

7、?1?2??清蛋白?1?2??血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成正常值：白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％血漿蛋白的主要功能:維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值,維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質(zhì),代謝物,激素,藥物及金屬離子等免疫作用七、臨床意義急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2和β球蛋白升高；慢性活動性肝炎、肝硬化：白