銀染步驟及注意事項(xiàng).docx

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1、銀染步驟是1固定10冰乙酸min。2清洗雙蒸水沖洗凝膠次每次1min。3染色染色液1g硝酸銀.5mL37甲醛1L雙蒸水。現(xiàn)配染色30min。4清洗迅速洗凝膠次。5顯影30g碳酸鈉1.5mL37甲醛200uL10mg/L硫代硫酸鈉。顯影至清晰帶紋出現(xiàn)。成功銀染的關(guān)鍵因素包括1用超純水比如NANOpure或Milli-Q純化或者是雙蒸水作銀染。2用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級(jí)的碳酸鈉。3在染色后水清洗所用時(shí)間的長(zhǎng)短很重要用不超過(guò)5-10秒的時(shí)間清洗膠然后放入顯色溶液中一般在水里浸一下就好。4甲醛和硫代硫酸鈉ul/1ml在使用前及時(shí)加入到顯色液中。5在使用前及時(shí)配染色液。

2、銀染的方法種類很多目前有文獻(xiàn)報(bào)道的就有100多種。但是其準(zhǔn)確的染色機(jī)制還不是特別的清楚。大致的原理是銀離子在堿性pH環(huán)境下被還原成金屬銀沉淀在蛋白質(zhì)的表面上而顯色。由于銀染的靈敏度很高可染出膠上低于1ng/蛋白質(zhì)點(diǎn)故廣泛的用在2D凝膠分析上及極低蛋白含量測(cè)定的垂直凝膠中。這里介紹的是我們實(shí)驗(yàn)室成功運(yùn)用的銀染方法對(duì)關(guān)鍵操作及要求做了補(bǔ)充主要是用于垂直凝膠電泳中低豐度蛋白的檢測(cè)如內(nèi)源性GST-Pulldown、Co-IP等實(shí)驗(yàn)中相互作用蛋白的研究銀染操作規(guī)程實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)原理在堿性條件下用甲醛將蛋白帶上的硝酸銀銀離子還原成金屬銀以使銀顆粒沉積

3、在蛋白帶上。染色的程度與蛋白中的一些特殊的基團(tuán)有關(guān)不含或者很少含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)有時(shí)候呈負(fù)染。銀染的詳細(xì)機(jī)制還不是非常清楚。試劑乙醇、冰醋酸、乙酸鈉、硫代硫酸鈉、硝酸銀、碳酸鈉、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛實(shí)驗(yàn)操作程序固定30min或者更長(zhǎng)時(shí)間o100ml乙醇40乙醇o(jì)25ml冰醋酸10冰醋酸o加水到250ml致敏30mino75ml乙醇30乙醇o(jì)17g乙酸鈉28.2g三水乙酸鈉o0.5g硫代硫酸鈉o加水到終體積250ml水洗3x10min銀染20mino0.625gAgNO3o100ul37甲醛在使用前加入o加水到終體積250ml水洗2x1min注

4、意把握時(shí)間水洗時(shí)間長(zhǎng)顯色速度慢點(diǎn)的顏色偏黃色顯色視情況而定o6.25gNa2CO3o50ul37甲醛在使用前加入o加水到終體積250ml終止10mino3.65gEDTA.Na2.2H2O或者1g甘氨酸o加水到終體積250ml保存1冰醋酸4℃注意事項(xiàng)1固定時(shí)間較長(zhǎng)則加一步水洗30min以免膠太脆而破碎。2甲醛在使用前加入。3最好多配制一份顯色液第一次顯色到溶液變混濁時(shí)換一份顯色液顯色到點(diǎn)清晰。4顯色過(guò)程很快要注意把握時(shí)間避免染色過(guò)度。5銀染液和顯色液需要預(yù)冷。6所用器皿要很潔凈不用手直接接觸以免雜蛋白污染7清洗用水盡量用高純度去離子水蒸餾水更佳可以減少背景著色。