銀染操作步驟.doc

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1、銀染操作步驟1.固定：電泳結束后，取凝膠放入約100ml固定液中，在搖床上室溫搖動20分鐘，搖動速度為60-70rpm。固定40分鐘以上甚至過夜可以進一步降低背景。固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40mlMilliQ級純水或雙蒸水，混勻后即成100ml固定液，可大量配制室溫存放。2.30%乙醇洗滌：棄固定液，加入100ml30%乙醇，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。30%乙醇的配制：70mlMilliQ級純水或雙蒸水中加入30ml乙醇，混勻后即成100ml30%乙醇。3.水洗滌：（洗2次）棄

2、30%乙醇，加入200mlMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。4.增敏：（輔染）現(xiàn)配現(xiàn)用棄水，加入100ml銀染增敏液(1X)，在搖床上室溫搖動2分鐘，搖動速度為60-70rpm。銀染增敏液(1X)的配制：99mlMilliQ級純水或雙蒸水中加入1ml銀染增敏液(100X)，混勻后即為銀染增敏液(1X)。銀染增敏液(1X)配制后需在2小時內使用。銀染增敏液(100X)的配制：即2.8%硫代硫酸鈉溶液，需用黑袋包裹避光保存。5.水洗滌(共2次)：棄原有溶液，加入200mlMilliQ級純

3、水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1分鐘，搖動速度為60-70rpm。棄水，再加入200mlMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1分鐘，搖動速度為60-70rpm。6.銀染：棄水，加入100ml銀溶液(1X)，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。銀溶液(1X)的配制：99mlMilliQ級純水或雙蒸水中加入1ml銀溶液(100X)，混勻后即為銀溶液(1X)。銀溶液(1X)配制后需在2小時內使用，最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。銀溶液（100X）的配制：稱取5g硝酸銀，加水溶解并稀釋至500ml，搖勻即得1%的硝酸銀溶液，需用黑

4、袋包裹避光保存。7.水洗滌：棄原有溶液，加入100mlMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1-1.5分鐘，搖動速度為60-70rpm。注意：水洗滌的時間不能超過1.5分鐘。8.顯色：棄水，加入100ml銀染顯色液，在搖床上室溫搖動3-10分鐘，直至出現(xiàn)比較理想的預期蛋白條帶，搖動速度為60-70rpm。銀染顯色液的配制：90mlMilliQ級純水或雙蒸水中加入10ml銀染基本顯色液(10X),再加入0.05ml銀染顯色加速液(2000X)，混勻后即為銀染顯色液。銀染顯色液配制后需在20分鐘內使用。銀染基本顯色液(5X)的配

5、制：稱取碳酸鈉60g，加水溶解并稀釋至500ml，搖勻即得12%碳酸鈉溶液。9.終止：加適量EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二鈉)終止棄銀染顯色液，加入100ml銀染終止液(1X)，在搖床上室溫搖動10分鐘，終止時有氣體產生屬正?，F(xiàn)象，產生的氣體為二氧化碳。銀染終止液(1X)的配制：95mlMilliQ級純水或雙蒸水中加入5ml銀染終止液(20X),混勻后即為銀染終止液(1X)。銀染終止液(1X)配制后宜當天使用。10.水洗滌：棄銀染終止液，加入100mlMilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動2-5分鐘，搖動速度為60-70r

6、pm。11.保存：可在MilliQ級純水或雙蒸水中保存。或采用適當?shù)姆绞街苽涑筛赡z。常見問題：1.背景太深：a.顯色時間過長。通常顯色反應會在10分鐘內結束，顯色反應時間過長會導致背景很深。b.洗滌不充分。洗滌時間過短，或洗滌液加入的量不足，或者容器過于狹小導致?lián)u動時溶液不易充分混合，或搖動速度過慢，導致混勻不充分。請按照說明書的建議確保各種溶液的用量和作用時間，搖床的推薦速度為60-70rpm。c.凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去除干凈。一方面需確保固定的時間和固定液的用量，另一方面對于不是最常用的Bis-Tris緩沖的凝膠

7、需要更長的固定時間以充分去除凝膠中的原有緩沖成分，以降低背景。d.水的純度太低。需使用大于16MΩ·cm的高純度水。2.蛋白條帶非常淺：a.蛋白的半胱氨酸(Cysteine)殘基的含量特別低或幾乎沒有。半胱氨酸殘基的存在對于銀染非常重要，半胱氨酸殘基的含量過低會導致檢測靈敏度下降。b.銀染后水洗滌時間過長。在銀溶液染色時需嚴格控制水洗滌的時間，水洗滌的時間不能超過1.5分鐘，否則會導致過多的銀離子被洗去，導致檢測靈敏度下降。c.上樣量不足。本試劑盒檢測BSA的靈敏度可以達到0.3ng，對于不同的蛋白檢測靈敏度可能不同。對于一些蛋白

8、可能需要大于1ng的蛋白量才能被檢測到。d.固定步驟后的洗滌不夠充分。導致少量乙酸殘留，影響后續(xù)檢測。確保30%乙醇洗滌和水洗滌的用量和時間，可以適當延長洗滌時間。3.凝膠上出現(xiàn)小點或或其它非蛋白的痕跡：a.凝膠沒有充分被溶液浸沒。請注意選擇大小合