L_色氨酸生產(chǎn)菌質(zhì)粒穩(wěn)定性工藝研究.pdf

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1、第40卷第1期2011年1月發(fā)酵科技通訊L-色氨酸生產(chǎn)菌質(zhì)粒穩(wěn)定性工藝研究黃靜程立坤劉倩徐慶陽(yáng)謝希賢陳寧（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院天津300457）摘要：從工程應(yīng)用的角度研究L-色氨酸生產(chǎn)菌E.coliTRJH的質(zhì)粒穩(wěn)定性,采用30L自動(dòng)控制發(fā)酵罐觀察選擇壓力、溫度、溶氧、酵母抽提物和葡萄糖濃度等條件對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，該菌具有分裂不穩(wěn)定性，上述培養(yǎng)條件的變化均會(huì)對(duì)該菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。關(guān)鍵詞：L-色氨酸發(fā)酵質(zhì)粒穩(wěn)定性L-色氨酸(L-tryptophan)的化學(xué)名稱(chēng)為α-氨大學(xué)工業(yè)微生物菌種保

2、藏室提供。基-β-吲哚基丙酸，是Hopkins和Cole在1902年1.2培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)并分離到的一種氨基酸[1]種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，酵母膏15，（NH。L-色氨酸對(duì)人和4）2動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起著重要作用,因此被SO410，檸檬酸鈉0.5，MgSO4·7H2O5，KH2PO41.5，廣泛用于醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域[2]。近年來(lái)，隨著FeSO4·7H2O15mg，VB1100mg，四環(huán)素50mg，重組DNA技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用，為微生物5pH7.0~7.2，0.75×10Pa滅菌15min。

3、發(fā)酵法發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸提供了重大的技術(shù)支發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，酵母膏1，（NH4）2持，使得微生物發(fā)酵法成為大規(guī)模生產(chǎn)L-色氨酸SO44，檸檬酸鈉2，MgSO4·7H2O5，KH2PO42，F(xiàn)eSO4·的首選技術(shù)。由于大腸桿菌具有遺傳特性較清楚、57H2O100mg，pH7.0~7.2，0.75×10Pa滅菌15min。易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短并能實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表1.3培養(yǎng)方法達(dá)等特性，因而重組大腸桿菌得到廣泛地應(yīng)用[3]種子培養(yǎng)：吸取適量無(wú)菌生理鹽水于5支活。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)廣泛用于異源蛋白的表達(dá)

4、,質(zhì)化斜面(32℃培養(yǎng)24h)中，將所有菌懸液接入裝粒穩(wěn)定性是影響發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素,丟失質(zhì)粒2.0L種子培養(yǎng)基5L種子罐(上海保興)中；初始通的空細(xì)胞的出現(xiàn)導(dǎo)致所表達(dá)蛋白的產(chǎn)量下降。一氣量1L/min；攪拌轉(zhuǎn)速300r·m·p~700r·m·p；通過(guò)般情況下,質(zhì)粒增加了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān),與含質(zhì)粒自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0；培養(yǎng)溫度32℃；以的細(xì)胞相比,丟失質(zhì)粒的空細(xì)胞通常具有較高的泡敵消泡；待種子培養(yǎng)液OD600≈10~20時(shí)，接入比生長(zhǎng)速率[4-5]發(fā)酵培養(yǎng)基中。,若空細(xì)胞出現(xiàn)在發(fā)酵初期,將會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體。

5、外源基因表達(dá)后,由于代謝負(fù)擔(dān)的發(fā)酵培養(yǎng)：按10%接種量將種子液接入裝增加,質(zhì)粒穩(wěn)定性迅速降低[6]。16.2L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐(上海保興)中；初本文通過(guò)對(duì)不同選擇壓力、溫度、溶氧、酵母抽始通氣量2L/min；攪拌轉(zhuǎn)速500r·m·p~800r·m·p；提物、和葡萄糖濃度的分析，優(yōu)化了大腸桿菌(E.通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0；培養(yǎng)溫度coliTRJH)生產(chǎn)L-色氨酸分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝，顯著32℃；以泡敵消泡；發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基中葡萄糖提高了生產(chǎn)菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性和L-色氨酸產(chǎn)量。濃度降至一定值時(shí)，將80%

6、葡萄糖溶液以一定的脈沖速度流加至培養(yǎng)基中且維持發(fā)酵液中的葡萄1材料與方法糖濃度在所需濃度范圍。1.1菌種1.4質(zhì)粒缺失率的檢測(cè)大腸桿菌TRJH(trpEDCBA+tetR)，天津科技平板點(diǎn)種法：選擇幾個(gè)培養(yǎng)時(shí)間,隨機(jī)挑取在—15—發(fā)酵科技通訊第40卷非選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落,分別點(diǎn)種在對(duì)應(yīng)復(fù)制速率跟不上細(xì)胞分裂的速率[10]。發(fā)酵過(guò)程分的選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基平板上,觀察別采用不同的溫度(28℃、30℃、33℃、36℃)發(fā)酵兩種平板中菌體生長(zhǎng)情況,計(jì)算兩種平板上生長(zhǎng)36h時(shí)，采用平板點(diǎn)種法考察質(zhì)粒的缺失

7、情況。試的菌數(shù)比例,驗(yàn)證質(zhì)粒的缺失率[7]驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。。1.5分析方法1.5.1菌體生物量：菌體生物量以菌體干重表示，取10ml發(fā)酵液，1000r·m·p離心20min，將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平稱(chēng)重。1.5.2葡萄糖濃度：采用SBA-40C（山東科學(xué)院生物研究所）生物傳感儀測(cè)定。1.5.3L-色氨酸濃度：L-色氨酸含量采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定，色譜分離條件：AgilentC18(15圖2溫度對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響mm×4.6mm,3.5μm)，流動(dòng)相V(0.03%K

8、H2PO4溶液):由圖2可知，36℃時(shí)雖然獲得最高的菌體量，V(甲醇)=90:10，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)278nm；乙但是產(chǎn)酸卻不是最高的，質(zhì)粒丟失比較嚴(yán)重。說(shuō)明酸濃度測(cè)定采用RP-HPLC[8]溫度升高使生產(chǎn)菌比生長(zhǎng)速率過(guò)大從而增加了質(zhì)。粒分配不穩(wěn)定性。28℃時(shí)質(zhì)?；静粊G失，但是過(guò)2結(jié)果與討論低的溫度使菌體生長(zhǎng)緩慢產(chǎn)酸下降。因此需要選2.1選擇壓力對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響擇一個(gè)適