DB34∕T 2716-2016 兩系水稻不育基因鑒定功能標(biāo)記法.pdf

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1、ICS65.020.01B04DB34安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB34/T2716—2016兩系水稻不育基因鑒定功能標(biāo)記法Identificationoftwo-linericemalesterilegenes—functionalmarkermethod文稿版次選擇2016-09-27發(fā)布2016-10-27實(shí)施安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB34/T2716—2016前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)歸口單位：安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋豐順、楊劍波、倪大虎、倪金龍、陸徐忠、李莉、汪秀峰、魏鵬程、楊亞春、

2、馬卉、李浩、秦瑞英、許學(xué)、李娟。IDB34/T2716—2016兩系水稻不育基因鑒定功能標(biāo)記法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了兩系水稻不育基因功能標(biāo)記檢測的術(shù)語和定義、原理、主要儀器、試劑與溶液、操作步驟、帶型記錄和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于兩系水稻不育基因鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)GB4404.1糧食作物種子第1部分:禾谷類GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試

3、驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1功能標(biāo)記FunctionalMarker根據(jù)基因內(nèi)部引起表型性狀變異的功能突變位點(diǎn)開發(fā)出來的一種分子標(biāo)記。3.2兩系水稻Two-LineRice本標(biāo)準(zhǔn)將兩系不育系和兩系雜交水稻統(tǒng)稱為兩系水稻。兩系不育系是指利用水稻的光溫敏核不育特性選育的水稻雄性不育系，其在短日低溫條件下表現(xiàn)為雄性可育，可以繁殖種子，在長日高溫條件下表現(xiàn)為雄性不育，可用于雜交稻制種。兩系雜交水稻是指利用兩系不育系與恢復(fù)系雜交產(chǎn)生的F1代。3.3標(biāo)準(zhǔn)樣品StandardSample標(biāo)準(zhǔn)樣品是指經(jīng)權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定認(rèn)證的代表已知品種特征特性的樣品。本標(biāo)準(zhǔn)中包括陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品和陽

4、性標(biāo)準(zhǔn)樣品。陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品是指不攜帶pms3基因和tms5基因的水稻種子、幼葉或DNA。1DB34/T2716—2016陽性標(biāo)準(zhǔn)樣品是指攜帶pms3基因或tms5基因的水稻種子、幼葉或DNA，包括pms3型不育系標(biāo)準(zhǔn)樣品、pms3型雜交水稻標(biāo)準(zhǔn)樣品、tms5型不育系標(biāo)準(zhǔn)樣品和tms5型雜交水稻標(biāo)準(zhǔn)樣品。3.4送驗(yàn)樣品SubmitSample送到種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)的樣品。4原理4.1生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的兩系水稻按其不育基因種類可分為pms3型和tms5型兩類。4.2根據(jù)不育基因pms3和tms5的功能突變位點(diǎn)序列與可育基因（PMS3和TMS5）不同，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增功能突變位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶

5、特異切割不育基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，而不酶切可育基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，形成片段長度多態(tài)，從而將不育基因、可育基因以及兩者的雜合體區(qū)分開。5主要儀器5.1PCR擴(kuò)增儀5.2離心機(jī)：最大離心力≥12,000g5.3電泳檢測系統(tǒng)：水平電泳系統(tǒng)5.4微量移液器：規(guī)格分別為2μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，連續(xù)可調(diào)5.5低溫冰箱：最低溫度-20℃5.6凝膠成像系統(tǒng)5.7高壓滅菌鍋5.8電子天平：精確度0.001g5.9恒溫水浴鍋：溫控精確度±1℃5.10磁力攪拌器5.11微波爐5.12紫外分光光度計(jì)5.13酸度計(jì)：精度±0.01pH6試劑和溶液6.1試劑要求僅使用分析純試劑和符合GB/

6、T6682規(guī)定的一級水。6.2試劑6.2.1十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）6.2.2三羥甲基氨基甲烷堿（Tris-Base）6.2.3乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）6.2.4濃鹽酸6.2.5氫氧化鈉6.2.6氯化鈉2DB34/T2716—20166.2.7三氯甲烷6.2.8異戊醇6.2.9異丙醇6.2.10無水乙醇6.2.11液氮6.2.12DNA聚合酶及其GCBufferI和GCBufferII6.2.13四種脫氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），縮略為dNTPs6.2.14限制性內(nèi)切酶RsaI6.2.15兩系水稻不育基因功能標(biāo)記引物（引物序列見附

7、錄A）6.3溶液見附錄B。7操作程序7.1樣品制備7.1.1送驗(yàn)樣品可為水稻的種子、葉片或其他等效物。送驗(yàn)樣品為種子時(shí)，其分樣和保存應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定，種子發(fā)芽按GB/T3543.4規(guī)定執(zhí)行。7.1.2用于兩系水稻類型檢測的送驗(yàn)樣品，其純度應(yīng)符合GB4404.1的規(guī)定。隨機(jī)抽取至少5粒種子（或5個(gè)葉片），分別提取基因組DNA。委托方指定的單株葉片，可直接提取DNA。7.1.3用于兩系雜交水稻不育株率鑒定的送驗(yàn)樣品，應(yīng)隨機(jī)抽取至少100粒種子（