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《DB34∕T 3308-2018 兩系雜交水稻種子純度檢測 分子標(biāo)記法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS65.020.99B05DB34安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB34/T3308—2018兩系雜交水稻種子純度檢測分子標(biāo)記法Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod文稿版次選擇2018-12-29發(fā)布2019-01-29實(shí)施安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB34/T3308—2018前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站提出。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽省種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站、合肥豐樂種業(yè)股份有限公司、安徽省種子
2、管理總站、安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周桂林、胡曉玲、吳曉亮、曹玉潔、周賢達(dá)、張文曉、范家萌、周銳、周紅英、宗凱、張奇、徐麗媛、王鳳杰、胡娜、王兆賢、劉根、熊成國、王浩波。IDB34/T3308—2018兩系雜交水稻種子純度檢測分子標(biāo)記法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了兩系雜交水稻種子純度分子標(biāo)記檢測的原理、實(shí)驗(yàn)步驟、結(jié)果分析和報(bào)告。本標(biāo)準(zhǔn)適用于兩系雜交水稻種子純度鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.1農(nóng)作物種子
3、檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度鑒定GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T1433水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法3縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：basepair，堿基對(duì)CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脫氧核苷三磷酸PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis
4、，聚丙烯酰胺凝膠電泳PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SSR：simplesequencerepeat，簡單序列重復(fù)Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶ddH2O：雙蒸水（超純水）4原理我國生產(chǎn)上兩系水稻的不育基因主要為溫敏核不育基因tms5，其次為光敏核不育基因pms1、pms3，根據(jù)其對(duì)應(yīng)的特征標(biāo)記在品種中的等位基因型，可判斷該品種是否為兩系雜交水稻或不育系。同時(shí)，水稻的不同品種，其基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳的重復(fù)次數(shù)不同的簡單重復(fù)序列(SSR)，且SSR標(biāo)記具有共顯性，雜交種子具有雙親等位標(biāo)記互補(bǔ)帶型，針對(duì)不
5、同品種篩選其區(qū)別于其它品種的特征SSR標(biāo)記，通過SSR多態(tài)性分析，可判斷受檢種子是否為雜交種并區(qū)別正常個(gè)體與異品種個(gè)體。本標(biāo)準(zhǔn)綜合利用兩系不育基因特征標(biāo)記和不同品種特征SSR標(biāo)記，鑒定一定數(shù)量送驗(yàn)樣品中的正常個(gè)體數(shù)目或百分率，從而對(duì)整體樣品的一致程度作出評(píng)價(jià)。1DB34/T3308—20185儀器設(shè)備高壓滅菌鍋、超純水儀、高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋（30℃～100℃）、核酸蛋白測定儀、組織研磨儀、PCR擴(kuò)增儀、高壓電泳儀、垂直電泳槽及制膠附件、微量可調(diào)加樣器（2μL、10μL、100μL、1000μL）。6試劑和溶液配制所用試劑均為分析純，試劑配制用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一
6、級(jí)水的要求。6.1試劑6.1.1DNA提取十六烷基三甲基溴化銨、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉。6.1.2PCR擴(kuò)增2+引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、ddH2O、和Mg或者M(jìn)ix反應(yīng)混合液。6.1.3PAGE電泳去離子甲酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯青FF、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硼酸、尿素、親和硅烷、剝離硅烷、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、無水乙醇、四甲基乙二胺、過硫酸銨、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、氫氧化鈉。6.2溶液配制見附錄A。7實(shí)驗(yàn)步驟7.1取樣從送檢樣品中分取規(guī)定數(shù)量的試樣，試樣采用單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測。試樣的
7、抽取應(yīng)有代表性，符合GB/T3543.2的規(guī)定。試樣的檢測應(yīng)設(shè)置重復(fù)，重復(fù)的次數(shù)以達(dá)到GB/T3543.5規(guī)定的容許誤差范圍內(nèi)為止，每次重復(fù)的數(shù)量應(yīng)至少含有90粒種子。7.2DNA提取7.2.1CTAB法取待檢樣品的去殼種子、幼苗或葉片約200～300mg置于2.0mL離心管，充分研磨；每管加入700μL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30min，期間多次顛倒混勻；每管加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1）混合液，充分混合后靜置10min；10000g離心10min，吸取上清
