病毒空斑純化步驟.doc

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1、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)純化分離方案(1)將已準(zhǔn)備好的VERO細(xì)胞消化均勻鋪于6孔板中。(2)細(xì)胞長(zhǎng)成單層后吸去培養(yǎng)液，將病毒做10倍稀釋，共做5個(gè)梯度并向每孔滴加0.4ml稀釋好的病毒液,置37℃吸附2小時(shí)后棄殘液。(3)制備2％的瓊脂糖（PCR電泳膠一樣的瓊脂糖），置40－50℃水浴待用。101102103104105陰性對(duì)照(4)將上述瓊脂糖和雙倍維持液（1:1）混合后，加入培養(yǎng)板各孔，每孔2ml，使冷卻凝固成覆蓋層。(5)把培養(yǎng)板倒置，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。(6)制備含0.002％中性紅的2%瓊脂糖：雙倍維持液（1:1

2、），置40－50℃水浴待用。(7)吸取上述瓊脂加入培養(yǎng)板各孔，每孔2ml，使冷卻凝固成第二覆蓋層。(8)把培養(yǎng)板倒置，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48小時(shí)內(nèi)觀察結(jié)果。(9)挑出蝕斑下的細(xì)胞作病毒的進(jìn)一步增殖和鑒定。主要問(wèn)題：1、鋪完瓊脂糖層之后，24h之后細(xì)胞輪廓模糊，不清晰。48h之后有些孔的細(xì)胞基本上看不清了，但是這都不是病毒造成的。（支原體的存在會(huì)不會(huì)導(dǎo)致這種情況）2、使用中性紅染色在一開始就染色還是等病毒造成一定的噬斑再染色，覆蓋一層還是兩層瓊脂糖層？3、使用的瓊脂糖是不是有問(wèn)題，與瓊脂區(qū)別大不大？4、之前按照這個(gè)方法加了中性紅的

3、瓊脂糖層之后，細(xì)胞著色很不理想?？床怀雒黠@的染色區(qū)域，只是有些紅色的點(diǎn)點(diǎn)。5、溫度不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，因?yàn)榘盐盏暮芎茫?xì)胞不會(huì)被燙死的。就是不知道自己配制的液會(huì)不會(huì)由于滲透壓的原因?qū)е录?xì)胞死亡。6、一直拿不出照片的原因就是沒(méi)法看到空斑，板孔中不能顯示出一個(gè)一個(gè)比較像樣的噬斑，我挑也是挑病變情況有點(diǎn)不一樣的病灶。