病毒純化濃縮方法.doc

《病毒純化濃縮方法.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、病毒純化濃縮方法方法一超速離心沉淀法1儀器超速離心機(BECKMAN?OPTIMAL-80XP)50000~80000rpm相對離心力最大可達510000×g；高速冷凍離心機(BECKMAN?AVANTIJ-26XP)20000~25000rpm最大離心力為89000×g；超速離心管?(Beckman?344058)，Ultra-clear?SW28離心管2方法步驟（1）轉(zhuǎn)染后44-48小時，收集上清液到50ml離心管內(nèi)，并加入20ml?Production培養(yǎng)基以便第二輪病毒的收集。將收集的上清液4℃，4000g離心10分鐘，去除細胞碎片，然后0.45?μm濾膜過濾到40ml超速離心管中。

2、?（2）取6個Beckman超速離心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中風干并紫外消毒30min。（3）每個Ultra-clear?SW28管加入30ml?預先處理過濾過的病毒上清。（4）取一支10ml的移液管，吸取12?ml?20%的蔗糖溶液(PBS配制)。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出4?ml，形成一個蔗糖墊。同樣地，將剩下8?ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管，對剩下3管進行同樣處理。（5）務必確定離心管沒有裂縫且用PBS調(diào)整各管重量使兩兩平衡。（6）4℃離心，25000rpm?（82700g）2?h。（7）離心完畢后小心取出超速離心管，小心

3、棄去上清液，留下管底沉淀。管底可見少量的半透明或白色沉淀。?將超速離心管倒置在吸水紙上晾干約10min，并用Tip頭吸去管壁上多余的液體。（1）每管中加入100ul不含鈣和鎂的冷PBS洗下沉淀。（2）將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中，蓋上蓋子。（3）在4℃溶解2小時，每隔20分鐘輕輕震蕩。（4）4℃，500g離心1分鐘，使溶液集中于管底。（5）用200μl?移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中，分裝50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速凍后儲存在-80℃凍存。方法二?PEG-8000濃縮法(1)5X?PEG8000+NaCl配制稱

4、取NaCl?8.766?g;?PEG8000?50g溶解在200ml?Milli-Q純水中；121攝氏度?30min?濕熱滅絕?30min；保存在4℃。(2)使用0.45μm濾頭過濾慢病毒上清液；(3)每30ml過濾后的病毒初始液，加入5X?PEG-8000+NaCl母液7.5?ml；(4)每20～30min混合一次，共進行3-5次；(5)4度放置過夜；(6)4度，4000?g，離心?20min；(7)吸棄上清，靜置管子1～2分鐘，吸走殘余液體；?(8)加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；(9)集中后的病毒懸液分裝成50?μl每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80?℃方法三慢病毒

5、純化濃縮試劑盒1.?每10ml過濾后的病毒初始液，加入Concen?Solution?3ml，每20-30min混合一次，共進行3-5次。?2.2.?4℃放置過夜。?3.?4℃，3000?g，離心45min。?4.?去掉上清，靜置管子1-2min，吸走殘余液體。5.?加入無血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。?6.?病毒懸液分裝成200μl每份,保存在離心管中，速凍后儲存在-80?℃。