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1、第43卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報(bào)告第8期2015年8月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl187—1192DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150203氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定大菱鲆肌肉中羧甲基賴氨酸含量王菁田盛蘭孫偉紅林洪李振興¨(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島266003)(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島266071)摘要建立了大菱鲆肌肉中羧甲基賴氨酸(CML)的氣相色譜-質(zhì)譜(GC—MS)檢測(cè)方法。以大菱鲆為研
2、究對(duì)象，選用三氯甲丙酮對(duì)樣品進(jìn)行脫脂，經(jīng)硼氫化鈉還原、蛋白水解、凈化、衍生化(酯化與?；?后，進(jìn)行GC—MS選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式檢測(cè)。選取m／z392為定量離子，m／z392，365，333，305為定性離子。結(jié)果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面積與濃度在1～200g／L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，方法檢出限為1ms／kg，定量限為5ms／kg，3個(gè)加標(biāo)水平(10，150和350ms／kg)下的平均回收率在100％一104％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<5％(n=5)。關(guān)鍵詞羧甲基賴氨酸；大菱鲆；氣相色
3、譜．質(zhì)譜；衍生化1引言晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advancedglycationendproducts，AGEs)是食品中蛋白、脂質(zhì)和核酸等組分在熱加工過(guò)程中發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物?，其中羧甲基賴氨酸(N一carboxymethyl—lysine，CML)為主要標(biāo)志性產(chǎn)物J。研究表明，食品中AGEs與心腦血管疾病、腎臟疾病、糖尿病及其并發(fā)癥等慢性疾病有密切關(guān)系’4J。為更好地監(jiān)測(cè)其在食品中含量，建立靈敏可靠的檢測(cè)方法非常必要。目前，關(guān)于食品中CML檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)'5j、高效液相色譜法(
4、HPLC)J、液相色譜．質(zhì)譜聯(lián)用法(LC．MS)’m等。ELISA法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但假陽(yáng)性率高，僅能得到CML相對(duì)值(kU／g)；HPLC法通過(guò)衍生化使CML具有熒光性并定量分析，但該具有熒光特性的衍生物不穩(wěn)定，導(dǎo)致結(jié)果偏差較大；LC—MS具有良好的靈敏度，又避免了衍生化處理，但基質(zhì)干擾帶來(lái)的離子抑制效應(yīng)難以避免，且檢測(cè)成本昂貴¨。GC—MS具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢(shì)，有望開(kāi)發(fā)成有效的CML檢測(cè)方法。Am61ie[等運(yùn)用GC—MS對(duì)食品中CML進(jìn)行檢測(cè)，由于前處理、基質(zhì)差異等原因，雖成功檢測(cè)到奶粉等產(chǎn)
5、品中的CML，但未檢測(cè)到鮭魚(yú)中的CML。目前，尚未見(jiàn)水產(chǎn)品中CML確證檢測(cè)方法的報(bào)道。本研究以海水魚(yú)中重要養(yǎng)殖品種大菱鲆為研究對(duì)象，利用GC．MS測(cè)定魚(yú)肉中CML含量，定量限由150g／L_l降到5g／L，為水產(chǎn)品中CML檢測(cè)提供了技術(shù)參考。2實(shí)驗(yàn)方法2．1儀器、試劑與材料6890N／5973I氣相色質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，單四極桿，配有EI源。羧甲基賴氨酸(CML，純度98％，加拿大TRC公司)；二氯甲烷(色譜純，美國(guó)ACS公司)；三氟乙酸酐(色譜純，純度99％，北京百靈威科技有限公司)
6、；氯化亞砜(色譜純，純度999．5％，天津科密歐試劑公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。大菱鲆購(gòu)自青島南山水產(chǎn)市場(chǎng)，經(jīng)“三去”處理后，取背部肌肉絞碎，分裝后，置于一18~C保存?zhèn)溆谩?．2溶液配制準(zhǔn)確稱取10．00mgCML于10．00mL超純水，混勻，制成1mg／mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，分裝后，于一18~C保存?zhèn)溆?。配?moL／LHC1、0．2mol／L硼酸鹽緩沖液(pH9．2)、2mol／LNaBH4(溶于0．1moL／LNaOH)；取2015-05-07收稿；2015-
7、06．18接受本文系現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助(No．CARS-50)E—mail：lizhenxing@OUC．edu．cal188分析化學(xué)第43卷1．46mL氯化亞砜緩慢加入100mL甲醇中，制成衍生劑備用。2．3樣品前處理2．3．1脫脂準(zhǔn)確稱取200．0mg樣品于50mL離心管，加人2OmL脫脂液，混勻，于4~C以4000r／min離心15min，棄上清液；再加入20mL脫脂液，重復(fù)上述離心操作，棄上清液后以氮?dú)獯蹈?，得蛋白沉淀。本研究選取正己烷]、水．甲醇．三氯甲烷[1引、三氯甲烷一丙
8、酮3種脫脂液進(jìn)行比較。2．3．2硼氫化鈉還原為避免樣品中羰基化合物等經(jīng)后續(xù)高溫蛋白水解進(jìn)一步生成CML造成檢測(cè)結(jié)果偏大，向蛋白沉淀中添加2mL硼酸鹽緩沖液和400NaBH溶液，混勻，于4~C反應(yīng)8h。2．3．3蛋白水解將還原后的蛋白沉淀轉(zhuǎn)移至10mL安瓿瓶中，加入8mL6mol／LHC1，充人氮?dú)夂蠓馄?，?IO~C烘箱水解，得到蛋白水解液。2．3．4樣品凈化取50L蛋白水解液于1．5mL離心管，烘干后加入1mL超純水復(fù)溶，混勻后過(guò)0．22
