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1、實(shí)驗(yàn)六細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)9/16/2021一、目的1、了解細(xì)菌鑒定中常用的生理生化試驗(yàn)反應(yīng)原理。2、掌握細(xì)菌生理生化試驗(yàn)的方法。9/16/2021二、原理由于細(xì)菌特有的單細(xì)胞原核生物的特性，各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同細(xì)菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物學(xué)技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天，細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。9/16/2021三、材料1菌種大腸埃希氏菌（Escherichia?col
2、i）、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌的斜面菌種。2培養(yǎng)基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂斜面等。9/16/20213試劑5%的α-萘酚溶液、40％KOH溶液、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚。4器具超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、接種環(huán)等。9/16/2021四、流程糖類發(fā)酵試驗(yàn)→V-P試驗(yàn)→M.R試驗(yàn)→吲哚試驗(yàn)→硫化氫試驗(yàn)→三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)9/16/2021五、步驟(一)糖類發(fā)酵試驗(yàn)1目的了解不同細(xì)菌分解利用糖的能力及實(shí)驗(yàn)原理，并掌握其操作方法。9/16/2
3、0212原理可根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察是否產(chǎn)生氣泡來判斷。9/16/20213材料3.2菌種大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）、沙門氏菌的斜面菌種3.３ 培養(yǎng)基葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管9/16/2021４
4、流程發(fā)酵液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄9/16/20215步驟5.1試管標(biāo)記取分別裝有葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對照。9/16/20215.2接種以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對照均不接菌。置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結(jié)果。9/16/20219/16/20219/16/20215.3觀察記錄與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記
5、錄用“－”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“＋”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“－”表示。9/16/2021(二)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V．P試驗(yàn))1.目的檢測細(xì)菌能否利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法。9/16/20212原理葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰與胍基生成紅色化合物某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解
6、葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。9/16/20213材料(1?)、菌種大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌的斜面菌種(2)、培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(3)、試劑V-P指試劑9/16/2021４流程培養(yǎng)液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄9/16/20215步驟（1）、標(biāo)記試管取4支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門氏菌和空白對照。9/16/2021（2）、接種培養(yǎng)以無菌操
7、作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)48～72h。9/16/2021（3）、觀察記錄取出以上試管，先加甲液（6%的α-萘酚溶液）0.5毫升,再加乙液（40％KOH溶液）0.5毫升,充分混勻,靜置15min后，若培養(yǎng)液呈紅色者，記錄為V.P.試驗(yàn)陽性反應(yīng)（用“＋”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“－”表示）。1小時(shí)后可出現(xiàn)假陽性。9/16/20219/16/2021（三）甲基紅試驗(yàn)（M.R.試驗(yàn)）1、目的檢測細(xì)菌能否分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸的能力。了解鑒別腸桿菌科各
8、菌屬的甲基紅試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法。9/16/20212、原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。9/16/20213、材料（1）、菌種大腸埃希氏菌（Escherichia?co
