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1、實(shí)驗(yàn)六-細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)一、目的1、了解細(xì)菌鑒定中常用的生理生化試驗(yàn)反應(yīng)原理。2?、掌握細(xì)菌生理生化試驗(yàn)的方法。9/26/2021二、原理由于細(xì)菌特有的單細(xì)胞原核生物的特性，各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同細(xì)菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質(zhì)的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產(chǎn)物也不相同，也就是說(shuō)，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物學(xué)技術(shù)和手段不斷發(fā)展的今天，細(xì)菌的生理生化反應(yīng)在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。9/26/2021五、步驟(一)糖類發(fā)酵試驗(yàn)1目的了解不同細(xì)菌分解利用糖的能力及
2、實(shí)驗(yàn)原理，并掌握其操作方法。9/26/20212原理可根據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)指示劑的顏色變化來(lái)判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察是否產(chǎn)生氣泡來(lái)判斷。9/26/20213材料3.2菌種大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter?aerogenes）、沙門(mén)氏菌的斜面菌種3.３
3、培養(yǎng)基葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管9/26/2021４流程發(fā)酵液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄9/26/20215步驟5.1試管標(biāo)記取分別裝有葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門(mén)氏菌和空白對(duì)照。9/26/20215.2接種以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對(duì)照均不接菌。置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結(jié)果。9/26/20219/26/20219/26/20215.3觀察記錄與對(duì)照管比較，若接種培
4、養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“＋”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒(méi)有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“－”表示。9/26/2021(二)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V．P試驗(yàn))1.目的檢測(cè)細(xì)菌能否利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法。9/26/20212原理葡萄糖丙酮酸乙酰
5、甲基甲醇二乙酰與胍基生成紅色化合物某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng)。9/26/20213材料(1?)、菌種大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門(mén)氏菌的斜面菌種(2)?、培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基(3)、試劑V-P指試劑9/26/2021４流程培養(yǎng)液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄9/26/20215步驟（1?）、標(biāo)記試管取4支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)
6、記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門(mén)氏菌和空白對(duì)照。9/26/2021（2）、接種培養(yǎng)以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)48～72h。9/26/2021（3??）、觀察記錄取出以上試管，先加甲液（6%的α-萘酚溶液）0.5毫升,再加乙液（40％KOH溶液）0.5毫升,充分混勻,靜置15min后，若培養(yǎng)液呈紅色者，記錄為V.P.試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)（用“＋”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“－”表示）。1小時(shí)后可出現(xiàn)假陽(yáng)性。9/26/20219/26/202
7、1（三）甲基紅試驗(yàn)（M.R.試驗(yàn)）1、目的檢測(cè)細(xì)菌能否分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸的能力。了解鑒別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法。9/26/20212、原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。9/26/20213?、材料（1?）、菌種大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門(mén)氏菌的斜面菌種（2?）、培養(yǎng)基葡萄糖蛋
8、白胨水培養(yǎng)基9/26/20214??流程培養(yǎng)液試管→標(biāo)記→接種→培養(yǎng)→指示劑→觀察→記錄9/26/2021（1?）、標(biāo)記試管取4支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、沙門(mén)氏菌和空白對(duì)照。5?、?步驟9/26/2021（2）、接種培養(yǎng)以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)48～72h。9/26/2021（3??）、觀察記錄取出以上試管，各加入5～
