流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂多糖對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞活性和免疫功能的影響.pdf

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1、第33卷第1期2011年1月海洋學(xué)報(bào)ACTA0CEANoLOGICASINICAV01.33。No.1January20l1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂多糖對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞活性和免疫功能的影響冼健安1’2,王安利1’弘,苗玉濤h2,伍娟1’2(1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州市510631;2.華南師范大學(xué)生命科學(xué)院生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510631)關(guān)鍵詞:脂多糖;羅氏沼蝦;血細(xì)胞;免疫反應(yīng);流式細(xì)胞術(shù)中圖分類號(hào):Q952.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A‘文章編號(hào):0253—4193(2011)

2、01—0170—081引言中的應(yīng)用打下一定的基礎(chǔ)。革蘭氏陰性菌是蝦類的一大致病菌,深入了解蝦類對(duì)革蘭氏陰性菌的免疫防御機(jī)制以及革蘭氏陰性菌對(duì)蝦類的致病機(jī)理,對(duì)蝦類健康養(yǎng)殖有著重要的科學(xué)和實(shí)踐意義。脂多糖(tipopolysac-charide,LPS),即內(nèi)毒素,是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁最外層的一層較厚的類脂多糖類物質(zhì),具有很強(qiáng)的抗原性和毒性[1-2]。甲殼動(dòng)物的非特異性免疫機(jī)制能夠識(shí)別LPS為非己物質(zhì),并作出一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng),即LPS能誘導(dǎo)提高機(jī)體的非特異性免疫能力[2],因此LPS也常作為免疫刺激劑添加到餌料中,以達(dá)到增強(qiáng)蝦體的抵抗力、

3、改善養(yǎng)殖效果的目的,但對(duì)其作用的具體機(jī)制尚不明確。本研究把羅氏沼蝦血細(xì)胞在離體外添加LPS刺激,在不同的處理時(shí)間取樣檢測(cè)其活性和功能的變化,以進(jìn)一步研究LPS對(duì)蝦類非特異性免疫功能的影響,探討蝦類對(duì)抗病原菌的免疫機(jī)制,為L(zhǎng)PS作為免疫多糖的添加使用提供一定的依據(jù),并為流式細(xì)胞術(shù)在甲殼動(dòng)物血細(xì)胞免疫功能研究2材料和方法2.1材料羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)購于廣州黃沙水產(chǎn)品交易市場(chǎng),體長(zhǎng)為10~14cm,在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5d后,選取附肢完整、無病患、活力強(qiáng)的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)用蝦。碘化丙啶(propidiumiodide

4、,PI)、黃綠色人工熒光微球(直徑1ttm)、2’,7’一二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH—DA)、LPS(Esche—richiacoli)均購自美國(guó)Sigma公司。2.2血細(xì)胞樣品的制備用1mL一次性注射器吸取200弘I。預(yù)冷的蝦血抗凝劑(450mmol/dm3NaCl,10mmol/dm3KCl,10mmol/dm3HEPES,10mmol/dm3EDTA—Na2,pH7.3),然后從蝦的圍心腔抽取200弘I。血淋巴。取足量的血淋巴后將其混合、離心(800×g,4℃,10min),棄去上清液后加等量的蝦生理鹽水[-450mmol/dm

5、sNaCl。10mmol/dmsKCl,10mmol/dm3HEPES,pH7.3,蝦鹽溶液(shrimpsaltsolution,收稿日期:2009—04-19;修訂日期:2010一l卜19。基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30671628);廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合資助項(xiàng)目(20061)90204005);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD29806)}廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20078020708013);廣東省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(2009A020101006);廣州市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(200921一E681)。作者簡(jiǎn)介:冼健安(1983一

6、),男,廣東省鶴山市人,博葉=研究生,研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)。E-mail:xian-ja@163.corD.*通信作者:王安利(1957一),男,河北省灤南縣人,教授,博上生導(dǎo)師,從事水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)和健康養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)的教學(xué)和研究。E~mail:wanganl@SCnLI.edu.cn1期冼健安等:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂多糖對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞活性和免疫功能的影響171sss)3重懸細(xì)胞,用10mL離心管分裝為7管,每管6mL。2.3脂多糖處理7管中在其中6管血細(xì)胞懸液分別添加以下試劑進(jìn)行處理:3個(gè)濃度的i.PS(1,3和5ttg/cm3),

7、同時(shí)添加3ttg/cm3LPS和100ttg/cm3胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor,TI)(LPS+TI組),只添加Tl(T1組)、不添加任何物質(zhì)處理的血細(xì)胞懸液作為空白對(duì)照組。余下1管分為兩份用作酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活力檢測(cè)的陽性對(duì)照,一份同時(shí)添加3ttg/cm3LPS和3(g/cm3胰蛋白酶(LPS+T組),另一份只添加胰蛋白酶(T組)。將細(xì)胞懸浮液置于室溫孵育,于一定的時(shí)間取樣檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.4流式細(xì)胞儀分析實(shí)驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀是美國(guó)BD(BectonDick—inson)公司生產(chǎn)的FA

8、CSCalibur,應(yīng)用CellQuest軟件(BectonDickinsonImmuno—cytometrySystems,SanJose,CA)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取和分析。每個(gè)

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