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《羅非魚無(wú)乳鏈球菌DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、第43卷第12期2013年12月中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)PERIODICALOFOCEANUNIVERSITYOFCHINA43(12)：030～035Dec．2013羅非魚無(wú)乳鏈球菌DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究+王蓓L2，u，簡(jiǎn)紀(jì)常2，u，蔡雙虎2?，黃郁蔥2?，湯菊芬2”，吳灶和3’4”(1．中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島266003；2．廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524025；3．廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524025；4．仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州510225)摘要：為研究羅非魚源無(wú)乳鏈球菌重組DNA疫苗對(duì)魚體的免疫保
2、護(hù)作用，將Sip基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNAa．1(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-Sip，并以肌肉注射方式免疫吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)。免疫后第7、28天取樣，采用PCR及RT-PCR方法檢測(cè)pcDNA-Sip在各個(gè)組織(包括肌肉、脾臟、頭腎、鰓及肝臟)中的表達(dá)情況；分別于免疫后第7、14、21、28天采集血清，使用ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)；免疫28d后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，計(jì)算疫苗的免疫保護(hù)率。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pcDNA-Sip可以在上述各組織中被檢測(cè)到；免疫21d后抗體效價(jià)出現(xiàn)峰值達(dá)1：5120；免疫保護(hù)率為90％。由此證實(shí)
3、，pcDNA-Sip重組質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)染到羅非魚組織細(xì)胞，并可在魚體中持續(xù)表達(dá)，同時(shí)有較高的免疫保護(hù)率。關(guān)鍵詞：無(wú)乳鏈球菌；免疫；羅非魚；重組DNA疫苗中圖法分類號(hào)：$941．42文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1672—5174(2013)12—030—06無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是一種革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，因最先從患乳房炎的牛中分離而得名。近年來(lái)，在廣東、廣西、海南等省羅非魚養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)了一種流行病，其病癥主要為體色發(fā)黑，眼球突出，鰓蓋內(nèi)側(cè)發(fā)紅、充血或強(qiáng)烈出血等。本實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)對(duì)瀕死病魚病灶組織分離細(xì)菌，培養(yǎng)并鑒定，確定引起廣
4、東地區(qū)暴發(fā)的大規(guī)模流行病的病原為無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，這與張新艷等[1]報(bào)道的情況相似。無(wú)乳鏈球菌因其細(xì)胞壁多糖類C物質(zhì)屬于Lance—field抗原結(jié)構(gòu)分類中的B群，所以又稱為B群鏈球菌(groupBStreptococcus，GBS)，根據(jù)其莢膜多糖抗原性的不同，可分為9種血清型。Giraudo等E2]用滅活的無(wú)乳鏈球菌作為疫苗免疫乳牛，發(fā)現(xiàn)各個(gè)血清型之間無(wú)交叉保護(hù)力，不能產(chǎn)生保護(hù)性。尋找一種能在各個(gè)血清型之間都有保護(hù)性的抗原是開(kāi)發(fā)無(wú)鏈球菌疫苗的有效方式。Brodeur等E3]采用免疫學(xué)篩選的方法從基因庫(kù)中鑒定純
5、化出一種表面免疫相關(guān)蛋白(Surfaceim—munogenicprotein，Sip)，該蛋白可有效地保護(hù)小鼠免遭5種血清型無(wú)乳鏈球菌的致死感染。由于Sip具有高度的保護(hù)性，廣泛存在于各血清型的無(wú)乳鏈球菌中，在細(xì)菌黏附和定植方面也起到重要作用，可作為無(wú)乳鏈球菌主要候選疫苗靶基因之一。DNA疫苗是繼滅活疫苗及亞單位疫苗之后的新型第三代疫苗，因其具有良好的安全性和保護(hù)性越來(lái)越受到了廣泛的關(guān)注。早在1991年Hansen等就對(duì)鯉魚進(jìn)行了魚類DNA疫苗的研究，并取得了良好的應(yīng)用效果[4]，此后科學(xué)家們?cè)诙喾N魚類身上進(jìn)行了嘗試[5書]。本研究旨在將具有良好免疫原性
6、的Sip蛋白與DNA疫苗技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建Sip真核表達(dá)重組質(zhì)粒并作為抗原來(lái)免疫吉富羅非魚，對(duì)其免疫效果及轉(zhuǎn)染的組織分布進(jìn)行探討，旨在探究魚用DNA疫苗在防治羅非魚無(wú)乳鏈球菌病的可行性，為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。1材料和方法1-1材料Streptococcusagalactiae菌株ZQ091o從廣東肇慶市崗美羅非魚場(chǎng)分離。大腸桿菌DH5a、表達(dá)載體pcDNA3．1(+)為本室保存，Anti—Tilapia(Oreochromisniloticus)IgMmonoclonalantibody為英國(guó)AquaticDiagnosticsLtd公司產(chǎn)品。
7、細(xì)菌及動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)白天根生化科技(北京)有限公司，pMDl8-T載體、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶，DNAMarker、DNA膠回收試劑盒購(gòu)于TAKARA公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒(PureLinkHiPurePlasmidFilterPurificationKits)購(gòu)于英韋創(chuàng)津公司，cDNA一鏈合成試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為博士德公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用吉富羅非魚購(gòu)于湛江國(guó)聯(lián)水產(chǎn)開(kāi)發(fā)股份有限公司，暫*基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009CBll8704)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃前期項(xiàng)
8、目(2011CBlll600)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010130
