[精品]紫外誘變育種方案.doc

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1、紫外誘變大腸桿菌str（鏈霉素）抗性突變株的篩選一、H的要求1、觀察紫外線對鏈霉索產(chǎn)?？剐缘恼T變效應(yīng)2、學(xué)習(xí)并掌握物理誘變育種的方法。二、基本原理紫外線的波長在200^380nmZ間，但對誘變最有效的波長僅僅是在253、265nm,一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254nmo紫外線誘變的主要生物學(xué)效應(yīng)是由于DMA變化而造成的，DNA對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基屮的U密噪，它比嚓吟更為敏感。紫外線引起DNA結(jié)構(gòu)變化的形式很多，如DNA鏈的斷裂、堿基破壞。但其最主要的作用是使同鏈DNA的相鄰唏噪間形成胸腺唏喘二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。經(jīng)紫外線

2、損傷的DNA,能被可見光復(fù)活，因此，經(jīng)誘變處理后的微生物菌種要避免長波紫外線和可見光的照射，故經(jīng)紫外線照射后樣品需用黑紙或黑布包裹。另外，照射處理后的泡子懸液不要貯放太久，以免突變在黑暗屮修復(fù)。三、實驗材料（~）菌種人腸桿菌（二）培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）1.肉膏蛋白月東培養(yǎng)基牛肉膏0.5g蛋白腺1.0gNad0.5g水100mLpH7.2100KPa、121°C高壓蒸汽滅菌20mirio如配制固體培養(yǎng)基需加瓊脂1?5%?2%。如配制半固體培養(yǎng)基則加瓊脂0.7%?0.8%。（三）主要藥品牛肉膏、蛋白月東、NaCl.可溶性淀粉、鏈霉索。(%1)主要器皿試管30支、移液管ImLlO支、5汕3支、1

3、0也1支、錐形瓶10個、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿30個、離心管、20W紫外燈、磁力攪拌器、離心機、紫外誘變箱等。四、實驗內(nèi)容(―)誘變1.菌懸液的制備出發(fā)菌株移接新鮮斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16?24h。取已培養(yǎng)20h的活化大腸桿菌斜面一支，用10mL生理鹽水將菌苔洗下，取4mL于5mL離心管屮離心(3000r/min)15niin,棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，最后制成菌懸液并倒入盛有玻璃珠的錐形瓶屮，強烈振蕩10min,以打碎菌塊制成單菌懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為107mLo2.平板制作將肉膏蛋白月東培養(yǎng)基熔化后，冷至45°C左右倒平板。待平板完全冷卻后

4、，取0.ImL鏈霉索用無菌棒涂布于平板上。其屮留三塊平板不涂布鏈霉索作為對照。3.誘變處理(1)預(yù)熱正式照射前開啟紫外燈預(yù)熱30mine(2)攪拌取制備好的菌懸液5mL移入6cm的無菌培養(yǎng)皿屮，放入無菌磁力攪拌捧，置磁力攪拌器上，20W紫外燈下30cm處。(3)照射然后打開皿蓋邊攪拌邊照射,劑量分別為5s,10s,15so可以累積照射，照射完畢先關(guān)上皿蓋再關(guān)閉攪拌和燈。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行。4.稀釋涂平板在紅燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各0.5mL進(jìn)行適半稀釋分離。取最后3個稀釋度的稀釋液涂于肉膏蛋白豚平板上，每個稀釋度涂3個平板，每個平板加稀釋液0.1mL,

5、用無菌玻璃刮棒涂勻，37°C培養(yǎng)48h(用黑布包好平板)。注意在每個平板背后要標(biāo)明處理吋間、稀釋度、組別。(%1)計篡存活率及致死率1.存活率將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出對照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。存活率二處理后1mL菌液屮活菌數(shù)十對照1mL菌液小活菌數(shù)1.致死率致死率二（對照1mL菌液屮活菌數(shù)一處理后1mL菌液屮活菌數(shù)）/對照1mL菌液小活菌數(shù)2.突變率自發(fā)突變率=誘變前樣品H'Str抗性菌數(shù)/誘變前活菌數(shù)突變率=后培養(yǎng)以后樣品i

6、-Str抗性菌數(shù)/后培養(yǎng)以后樣品屮的活菌數(shù)同樣計算用紫外線處理5s、10s、15s、后的存活細(xì)胞數(shù)及致死率。（三）誘變后

7、培養(yǎng)1.取lmL誘變處理好的菌懸液接入肉膏蛋白豚液體培養(yǎng)基屮進(jìn)行后培養(yǎng)，37°C120rpm搖瓶避光培養(yǎng)；2.對后培養(yǎng)的菌懸液進(jìn)行平板菌落計數(shù)。（四）菌株的篩選1.將經(jīng)過誘變后培養(yǎng)的菌懸液適半稀釋后，分別涂布于含最小抑制濃度的鏈霉索培養(yǎng)基平板上，37C培養(yǎng)長出的菌落即為鏈霉素抗性突變株。2?計抗性菌落數(shù)，計算誘發(fā)突變率，觀察紫外誘變的效果。五、實驗數(shù)據(jù)記錄與處理（-）將實驗結(jié)果按表要求如實填入，并分別算出存活率，致死率。表1紫外線處理后枯草芽泡桿菌的存活率及致死率照射時間5秒10秒15秒稀釋倍數(shù)菌落數(shù)平均菌落數(shù)存活率/%致死率/%對照組稀釋倍數(shù)菌落數(shù)平均菌落數(shù)存活率/%致死率/%