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1、8上海畜牧獸醫(yī)通訊2009年第2期型鴨肝炎病毒VP1基因克隆及其原核表達(dá)*孔留五康艷梅何逸民李小康潘全會張桂紅(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院廣東廣州510642)摘要根據(jù)Genbank中的型鴨肝炎病毒全基因序列設(shè)計了擴(kuò)增型鴨肝炎病毒VP1基因的包含有EcoRV和XhoI酶切位點(diǎn)的引物,用該特異性引物從型鴨肝炎病毒cDNA模板中擴(kuò)增得到目的基因VP1,以相同的限制性內(nèi)切酶酶切目的基因和表達(dá)載體pET32a后構(gòu)建重組表達(dá)載體,經(jīng)酶切及PCR鑒定篩選出陽性克隆,測序證明目的基因正確插入了表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化宿主菌
2、Rosseta,用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)VP1基因的表達(dá),收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。結(jié)果表明,VP1在大腸桿菌Rosseta中表達(dá)量較高,表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為48ku、并能被型鴨肝炎病毒陽性血清所識別。型鴨肝炎病毒VP1蛋白在大腸桿菌Rosseta中表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性。關(guān)鍵詞:型鴨病毒性肝炎病毒;VP1基因;誘導(dǎo)表達(dá)雛鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒引起的一種急性高度Xhol酶切位點(diǎn);取鴨胚尿囊液,按Invitrogen公司TRIzol致死性傳染病,主要侵害
3、4周齡以內(nèi)的雛鴨,特別是1周齡LSReagentRNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行,提取病毒以下的雛鴨最易感染,死亡率較高,是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,11%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。的傳染病之一。本病于1949年首次發(fā)現(xiàn)于美國的長島,1953年開始蔓延至世界各地。本病毒屬于小RNA病毒科,腸1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建:回收擴(kuò)增的DNA片段,與pMD18道病毒屬。現(xiàn)認(rèn)為DHV有個血清型:即、、型,型鴨肝炎-T載體連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5、經(jīng)菌液PCR、酶切和病毒(du
4、ckhepatitisvirus1,DHV1)又稱古典株(classicalDHV),此測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名pMD18-VP1,以Xhol、病毒流行甚廣,很多國家的流行病例均屬此病2。EcoR同時對pMD18-VP1與pET32a空載體雙酶切,回收型鴨肝炎病毒屬于小核糖核酸病毒科,病毒粒子呈正后連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta,經(jīng)酶切、測序和PCR二十面體結(jié)構(gòu),其組成為衣殼蛋白和一條由衣殼蛋白包裹的鑒定正確后,命名為pET32a-VP1。長約7.7kb左右的單鏈正股RNA組成,Ding2、Kim3~5、
5、1.3.3重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及選定:將陽性菌種Tseng6~8等報道型鴨肝炎病毒在遺傳進(jìn)化關(guān)系上與副腸pET32a-VP1在含氨芐(Amp100g/ml)的LB液體培養(yǎng)基孤病毒屬(Parechovirus)親緣關(guān)系較近。中培養(yǎng)至OD450值達(dá)0.5左右時,加入終濃度1.0mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)4h后,取菌液留樣SDS-PAGE型鴨肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1位于DHV1基因組的電泳鑒定表達(dá)情況。(1)IPTG濃度的優(yōu)化,誘導(dǎo)時間選定為2103~2816位,VP1全基因由714個核苷酸組成,編碼94h。
6、加入終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、238個氨基酸。然而,目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)型鴨肝炎1.8mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取不同IPTG濃度誘導(dǎo)表病毒蛋白基因和功能的研究。因此,本研究采用原核高效表達(dá)的菌液留樣,誘導(dǎo)4h后,SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)情達(dá)載體pET-32a在大腸桿菌Rosseta中表達(dá)了DHV1-R況。(2)誘導(dǎo)時間的優(yōu)化,誘導(dǎo)IPTG濃度選定為株的VP1蛋白,這為深入研究VP1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了1.0mmol/L。終濃度1.0mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘基礎(chǔ)
7、,也為研制DHV1的新型疫苗與診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。導(dǎo)0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h后,取不同時間表達(dá)1材料和方法菌液留樣,SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)情況。1.1毒株1.3.4重組蛋白免疫印記檢測:用型鴨肝炎病毒陽性血菌種、質(zhì)粒和型鴨病毒性肝炎病毒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸清,對表達(dá)的融合蛋白用蛋白質(zhì)印跡法檢測。經(jīng)SDS-醫(yī)學(xué)院禽病研究室保存、提供。大腸桿菌DH5,RossetaPAGE電泳分離蛋白后,用電轉(zhuǎn)移儀低溫穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移2.5h后,(DE3)由本課題組保存;質(zhì)粒pET-32a(+)、pMDl8-T取下
8、NC膜,以PBST(pH7.4的PBS0.5mlTween-20)沖Vector購自寶生物工程(大連)有限公司。洗后用封閉液(10mlPBST0.5mg脫脂奶粉)封閉過夜。用1.2試劑PBST沖洗后與型鴨肝炎病毒陽性血清37孵育
