利用顯色法快速篩選大豆脂肪氧化酶缺失突變體-論文.pdf

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1、2012年7月中國糧油學(xué)報(bào)V0l_27.No.7第27卷第7期JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationJu1.2012利用顯色法快速篩選大豆脂肪氧化酶缺失突變體董德坤姜瑩傅旭軍黃英運(yùn)袁鳳杰朱丹華(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所,杭州310021)(深圳華大基因研究院,深圳518083)摘要以杭州國家大豆改良分中心保存的野生和栽培大豆資源為研究材料,利用顯色法對大豆脂肪氧化酶自然缺失突變體進(jìn)行篩選。從348份種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)同時缺失大豆脂肪氧化酶Loxl和L0)【2的野生大豆種質(zhì)1份ZYD0451l,同

2、時缺失大豆脂肪氧化酶Lo)【2和Lox3野生大豆種質(zhì)1份ZYD04452,以及缺失大豆脂肪氧化酶Lox2或其含量極低的栽培大豆種質(zhì)5份:ZDD06271、ZDD06044、ZDD13834、ZDD06245和VP35。試驗(yàn)結(jié)果同時表明顯色法是一種簡便快速的大豆脂肪氧化酶缺失突變體篩選方法。關(guān)鍵詞大豆脂肪氧化酶突變體顯色法中圖分類號:$565.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1003—0174(2012)07—0l10—05大豆脂肪氧化酶(Lipoxygenas,EC1.13.11.12,缺失種質(zhì)用于優(yōu)良品種的選育將是一種十分有效的簡稱Lox)是一類含非血紅

3、素鐵、不含硫的蛋白質(zhì),分解決豆腥味問題的途徑。子質(zhì)量為94~97ku。在成熟大豆種子中約占總蛋本試驗(yàn)采用顯色法對杭州國家大豆改良分中心白的1%~2%。它能催化具有順,順一1,4一戊二烯保存的野生和栽培大豆種質(zhì)進(jìn)行分析篩選,以期獲結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng),如亞油酸、亞得大豆脂肪氧化酶缺失的優(yōu)良種質(zhì)。麻酸等生成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物,如乙醛和茉莉酮酸脂等,這些揮發(fā)性物質(zhì)導(dǎo)致大豆及l(fā)材料與方法其制品產(chǎn)生豆腥味¨-3]。Theorell等和Christopher1.1試驗(yàn)材料等先后分離純化了大豆脂肪氧化酶的3種同功酶從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院杭州國家

4、大豆改良分中心Lox一1、Lox2和Lox3(Lox3a、Lox3b)。在形成豆制品保存的野生和栽培大豆資源中隨機(jī)選取348份種質(zhì)揮發(fā)性氣味物質(zhì)和豆腥味物質(zhì)中,Lox2起主要作用,用于脂肪氧化酶缺失突變體的篩選。Loxl和Lox3作用相對較小-s]。Lox2缺失時豆腥大豆脂肪氧化酶缺失對照分別為:脂肪氧化酶味明顯降低,Lox2和Ix~x3同時缺失幾乎沒有豆腥全缺失品種大青豆(缺Loxl,2,3)記為kO;x2和味,當(dāng)Lox全缺失時根本不產(chǎn)生豆腥昧,并且LoxLox3缺失品種‘五星一號’記為L1;Lox2缺失品種的缺失對大豆的性狀并無顯著影響?!逍嵌?/p>

5、號’記為L13。其中‘五星一號’和‘五星二大豆加工過程中消除大豆脂肪氧化酶的主要手號’由河北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張孟臣研究員惠贈。段包括高溫加熱處理、微波處理、有機(jī)溶劑萃取和水1.2試劑與溶液配制解酶處理等。但是在處理的過程中大豆蛋白質(zhì)品亞油酸、吐溫、次甲基藍(lán)、二硫蘇糖醇(DTI')、硼質(zhì)會受到影響,其溶解度、黏性等特性降低或喪失;砂、硼酸磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tween20:上海生其他營養(yǎng)成分如維生素等也會受到破壞;同時加工工生物工程技術(shù)有限公司;B一胡蘿卜素:Sigma—的過程還增加了能量的消耗和生產(chǎn)成本的投入。而Aldrich公司;其他試劑均為分析純

6、。研究表明,使用Lox缺失大豆制作的豆制品不僅豆腥SLS(亞油酸鈉底物)溶液:分別稱取70.0mg亞味低,而且具有較高的蛋白質(zhì)水平、VE含量和清除油酸鈉和70.0mgTween20,將其溶于4.0mL水中,DPPH自由基的活性_l。因而篩選大豆脂肪氧化酶混合均勻后加0.55mL0.5mol/L的氫氧化鈉溶液基金項(xiàng)目:浙江省公益性項(xiàng)目(2011C22058)直到澄清,加蒸餾水定容至25.0mL,抽真空處理,而收稿13期:2011—10一O8后進(jìn)行分裝,液氮冷凍后置一80℃冰箱保存?zhèn)溆?。作者簡介:董德坤,男?978年出生,博士,大豆分子育種通訊作者:朱

7、丹華,男,1957年出生,研究員,大豆遺傳育種p—cs(B一胡蘿卜素底物)溶液:稱取10.0mg第27卷第7期董德坤等利用顯色法快速篩選大豆脂肪氧化酶缺失突變體111B一胡蘿卜素,加入10.0mL丙酮,充分溶解后濾紙放入分光光度計(jì)中,記錄A452變化,檢測時間5過濾,再加入與濾液等量的丙酮將其稀釋成50%飽min;以上檢測均記錄每隔10s的動態(tài)變化數(shù)據(jù)。和溶液,棕色瓶4℃保存。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分別配制0.2mol/LpH=9.0的硼酸鈉緩沖液、分光光度計(jì)法記錄的動態(tài)變化數(shù)據(jù)利用Origin—0.2mol/LpH=6.0的磷酸鈉緩沖液和0.2mol/LP

8、ro7.5軟件進(jìn)行繪圖。pH=6.6的磷酸鈉緩沖液備用。Loxl檢測溶液:分別取25.0mL0.2mol/L

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