菌種保存方法.doc

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1、菌種保存方法微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內使其不發(fā)生變異而又保持生活能力?！　〉蜏亍⒏稍锖透艚^空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的?！　”２胤椒ù笾驴煞譃橐韵聨追N：　　1．傳代培養(yǎng)保藏法　　又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內保存?！　?．液體石蠟覆蓋保藏法　　是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋

2、滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用?！　?．載體保藏法　　是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛?！　?．寄主保藏法　　用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏?！　?．冷凍保藏法　　可分低溫冰箱（-20—-3

3、0℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。　　6．冷凍干燥保藏法　　先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現象除去水分（真空干燥）?！　∮行┓椒ㄈ鐬V紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護劑來制備細胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細胞的損害。保護性溶質可通過氫和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩(wěn)定細胞成分的構型。保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等?！　∪?、器材　　細菌、酵母菌，放線菌和霉菌；　　肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，滅菌脫脂牛乳，

4、滅菌水，化學純的液體石蠟，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黃土或紅土，冰塊、食鹽，干冰，95％酒精，10％鹽酸，無水氯化鈣；　　滅菌吸管，滅菌滴管，滅菌培養(yǎng)皿，管形安瓿管，淚滴形安瓿管（長頸球形底），40目與100目篩子，油紙，濾紙條（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空壓力表，噴燈，L形五通管，冰箱，低溫冰箱（-30℃），液氮冷凍保藏器。　　四、操作步驟、各保藏法的應用范圍及優(yōu)缺點　　下列各法可根據實驗室具體條件與需要選做?！　?．斜面低溫保藏法　　將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，

5、移至2—8℃的冰箱中保藏?！　”２貢r間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2—4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次?！　〈朔閷嶒炇液凸S菌種室常用的保藏法，優(yōu)點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養(yǎng)基的物理、化學特性不是嚴格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會亦較多?！　?．液體石蠟保藏法　　（1）將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1．05kg/cm2>，121．

6、3℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用?！　。?）將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。　?。?）用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準（圖Ⅶ-12），使菌種與空氣隔絕?！　。?）將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）?！　〈朔▽嵱枚Ч?。霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保

7、藏3個月之久。此法的優(yōu)點是制作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意?！　?．濾紙保藏法　　（1）將濾紙剪成0．5×1．2cm的小條，裝入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2張，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃滅菌30分鐘。　?。?）將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長?！　。?）取滅菌脫脂牛乳1—2ml滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內，取數環(huán)菌苔在牛

8、乳內混勻，制成濃懸液?！　。?）用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。　?。?）將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干?！　。?）將棉花塞入管內，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存于低溫下?！　。?）需要使用菌種，復活培養(yǎng)時，可將安