線粒體d-loop區(qū)全序列分析a2a基因敲除小鼠生產(chǎn)擴(kuò)大群的遺傳穩(wěn)定性

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1、第27卷第4期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)V01．27NO．42010年8月LAB0RAT0RYANIMALSCIENCEAugust2010護(hù)勺研究·論著、護(hù)、護(hù)、驢、：2、g線粒體D—Loop區(qū)全序列分析A2a基因敲除小鼠生產(chǎn)擴(kuò)大群的遺傳穩(wěn)定性王金丹管敏強(qiáng)李淵陳錫文金龍金(1溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)(2．溫卅l醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫州325035)摘要：目的采用線粒體D—Loop全序列測(cè)定法對(duì)A2a基因敲除小鼠近交系生產(chǎn)擴(kuò)大群中的小鼠進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性分析。方法對(duì)5個(gè)子代A2a雜合子50只小鼠的線粒體DNAD—Loop區(qū)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后測(cè)序，其

2、結(jié)果與小鼠線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，分析50只小鼠之間的序列差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的50只小鼠的D—Loop基因序列完全一致，且與小鼠線粒體標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致。結(jié)論A2a基因敲除小鼠擴(kuò)大繁殖群具有較好的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)為進(jìn)一步研究A2a小鼠提供遺傳學(xué)資料。關(guān)鍵詞：A2a小鼠；線粒體DNAD．1oop區(qū)；序列分析中圖分類號(hào)：Q95—33文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006—6179(2010)04-0021—03實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的目的是為了保證動(dòng)物1材料和方法品種、品系的遺傳質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)一致，并使之在長(zhǎng)期的繁殖生產(chǎn)中遺傳質(zhì)量保持穩(wěn)定不變，從而確保動(dòng)物1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確

3、性、重復(fù)性和可比性。目前，許2005年l0月從美國(guó)波士頓大學(xué)引進(jìn)腺苷A2a多方法在不同程度上都存在著精確度不高、檢測(cè)位受體基因敲除小鼠6只，其中雄鼠3只，雌鼠3只。點(diǎn)及反映遺傳概貌等局限性。自從1979年Crews按近交系小鼠保種繁育方法在溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等人首次測(cè)定了人線粒體基因組的全序列后，現(xiàn)已中心{SYXK(浙)2005—0061}SPF級(jí)動(dòng)物房中WC有多種動(dòng)物的線粒體基因組全序列被測(cè)定，如大鼠、飼養(yǎng)繁殖。經(jīng)過(guò)l5代繁殖后，現(xiàn)從11—15代中每小鼠、水牛、綿羊、山羊、豬、馬、驢、雞、北京鴨等。線代取雜合子10只共50只。粒體DNA(mtDNA)相對(duì)分子質(zhì)

4、量小，拷貝數(shù)高，呈1．2主要試劑母系遺傳，由于線粒體沒(méi)有組蛋白的保護(hù)和無(wú)DNAPCR引物，根據(jù)小鼠標(biāo)準(zhǔn)序列及D—Loop基因位修復(fù)系統(tǒng)，因此它的突變率比核DNA高得多，其多置，按照引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表l。引物由態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域“。我們對(duì)美上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR聚合國(guó)引進(jìn)的近交系A(chǔ)2a基因敲除小鼠擴(kuò)大生產(chǎn)群中5酶試劑、DNA片段純化試劑盒為寶生物工程(大連)有個(gè)子代雜合子小鼠線粒體D—Loop基因全序列進(jìn)行限公司產(chǎn)品。瓊脂糖、Tris試劑為Promega公司進(jìn)口分測(cè)定，并作了遺傳學(xué)分析，為A2a基因敲除小鼠的裝；蛋白酶

5、K為Merk公司的產(chǎn)品；Tris一飽和酚(pH遺傳特征研究提供理論基礎(chǔ)。8．0)為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。表1引物名稱及序列收稿日期：2009—12—22基金項(xiàng)目：浙江省科技廳項(xiàng)目2008F80007作者簡(jiǎn)介：王金丹(1976一)，女，廣西南寧，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事遺傳學(xué)教學(xué)研究。通訊作者：管敏強(qiáng)(1968一)，男，碩士，副研究員，主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究。E—mail：guanmq968@163．com·22·實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)27卷1．3小鼠肝臟細(xì)胞的DNA提取所提取的DNA濃度為90～150ng，大部分為頸椎脫位法處死小鼠，再取肝臟組織勻漿處理，1

6、30ng；利用美國(guó)BECKMAN公司DU800核酸蛋白PBS洗滌使肝臟細(xì)胞脫落制成細(xì)胞懸液，PBS洗滌2分析儀測(cè)定DNA的純度OD260／OD280為1．6～次后收集的細(xì)胞加細(xì)胞裂解液700L(10mmol／L1．8，所提取的DNA可用作PCR反應(yīng)的需要。Tris，0．1mol／LEDTA，0．5％SDS)，加10g／LRNase2．2PCR擴(kuò)增結(jié)果1L，37℃消化30min，再加入20g／L蛋白酶K10只小鼠DNA標(biāo)本全部擴(kuò)增出特異性條帶，3p,L，65R2繼續(xù)裂解過(guò)夜(10～12h．)，Tris一飽和酚抽擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期產(chǎn)物片段大提，異丙醇

7、沉淀，70％已醇洗滌，60LTE溶解。小一致(圖1)。1．4PCR擴(kuò)增25L反應(yīng)體系中含3IxLDNA模板，上游引物小鼠肝臟線粒體D—loop區(qū)和下游引物(10I,zmol／L)各0．3L，2．5txLdNTP(2．5mmol／L)，2．5LMgC12(25mmol／L)，2．5L10×PCR緩沖液，0．1txLTaq酶。擴(kuò)增D—Loop區(qū)的反應(yīng)體系在94℃預(yù)變性5min，按94cIC變性20S，1000bp60℃退火30S，72oC延伸1min程序共循環(huán)35次，最2000bp后72℃終末延伸5rain。擴(kuò)增產(chǎn)物用2．5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1234567891

8、0marker陰性1．5