大豆原生質(zhì)體融合與植株再生的方法研究-論文.pdf

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1、學(xué)21術(shù)固.cadermct.1eldn◎■doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2012.02.012大豆原生質(zhì)體融合與植株再生的方法研究王繼安楊明亮黃珊珊楊繼學(xué)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所一教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室哈爾濱150030)大豆是重要的糧食作物和油料作物,常規(guī)的育種的組成為:CaC12·2H2O10mol/L,KH2PO40.2mmol/L,方法越來(lái)越受到基因狹窄的限制,使得單產(chǎn)水平提高緩KN031.0mmol/L,M。gS04。7H201.0mmol/L,CuSO4。5H2O慢。而轉(zhuǎn)基因

2、育種雖然可以打破物種的界限,有目的導(dǎo)0.1mol/L,KI10mol/L(Srinivasaneta1.,1986)將原人某個(gè)基因育成新品種,但對(duì)多基因控制的性狀的改進(jìn)生質(zhì)體混合液用雙層濾網(wǎng)(100~tm和38.51Xm)去掉沒(méi)有降難度很大,而且轉(zhuǎn)基因安全性方面受到人們的關(guān)注。我解的細(xì)胞及組織,收集濾液,~13mLCPW9mol/L[附加了們利用植物間的原生質(zhì)體融合克服遠(yuǎn)緣雜交,為大豆育9%(w/v)甘露醇的CPW溶液,pH5.81。80×g離L,5min,棄種另辟途徑,既打破了物種界限又確保安全性。通過(guò)原上清,再將沉淀

3、的原生質(zhì)體與1.5mL的CPW9mol/L混合,生質(zhì)體的不對(duì)稱融合,可保持大豆的有利基因,又可引然后輕輕加到3mL的CPW25S溶液【附加了25%(w/v)蔗糖入其他作物和植物的部分有利性狀,為大幅度提高大豆的CPW溶液,pH5.81頂部,形成一個(gè)界面,在100×下單產(chǎn)提供新的育種途徑和方法,從而育成突出優(yōu)良的大離心6—8min,原生質(zhì)體會(huì)在蔗糖溶液和甘露醇溶液之間豆新品種。形成一條原生質(zhì)體帶。這時(shí)用吸管小心的將原生質(zhì)體吸出,分別用CPW9mol/L溶液和培養(yǎng)基離心,然后在顯微1植物材料鏡下檢查原生質(zhì)體純化情況并進(jìn)行活性

4、檢測(cè),再用培養(yǎng)基懸浮進(jìn)行培養(yǎng)。由誘導(dǎo)野生大~_{Glyeinesoja)和普通大~fGlyeinemax)純化好的原生質(zhì)體的活性檢測(cè)是通過(guò)在熒光顯微鏡胚性愈傷組織,分別建立各融合親本的胚性細(xì)胞懸浮下觀察FDAfFluoresceinDiacetate)染色的原生質(zhì)體。取系。以普通大豆和野生大豆的胚性細(xì)胞懸浮系和體細(xì)胞0.5mL懸浮于液體培養(yǎng)基的原生質(zhì)體到1.5mL離心管,添幼胚為材料分離原生質(zhì)體。JJIFDA(2mg/mL,用丙酮配制)溶液到離心管使其終濃度為0.01%(w/v)?;旌弦狠p輕混合后在室溫條件下靜止2原生質(zhì)

5、體分離、純化和培養(yǎng)5min,取少許于載玻片成薄層,然后在熒光顯微鏡下檢測(cè),發(fā)出綠色或黃綠色熒光的原生質(zhì)體具有活性,不能約2g新鮮的顆粒狀胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移~1]40mLMS液發(fā)出熒光的是死細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的活力(在同一個(gè)體培養(yǎng)基的100mL=角瓶中,在回旋搖床120r/min上暗視野里在暗場(chǎng)里發(fā)熒光的原生質(zhì)體數(shù)占明場(chǎng)里所有原生培養(yǎng)。每隔7d,用小口吸管吸取細(xì)小懸浮顆粒,棄除大質(zhì)體數(shù)的百分率)。顆粒愈傷,并加入新鮮培養(yǎng)液繼代,這樣連續(xù)繼代培養(yǎng)純化好活性高的原生質(zhì)體懸浮于KM8P培養(yǎng)基(Kao3060d,得到生長(zhǎng)期均勻一致的

6、細(xì)小顆粒懸浮物。吸取andMichayluk,1975),不同的滲透壓調(diào)節(jié)劑和激素組合1g左右繼代23d的胚性細(xì)胞懸浮物置于直徑為60mm培養(yǎng)(表1),設(shè)置不同的培養(yǎng)密度(0.5X10610.0X106]mL)來(lái)皿中,并將調(diào)整好濃度的酶液添加2~3mL于培養(yǎng)皿中,篩選大豆原生質(zhì)體培養(yǎng)的最適密度。培養(yǎng)方法采用液體然后用Parafilm封口在28±1℃遮光的黑暗條件下,放淺層培養(yǎng)、固液雙層培養(yǎng)和瓊脂糖包埋培養(yǎng)。液體淺置在回旋搖床上40r/min酶解。酶解時(shí)間為14~16h。酶液層培養(yǎng)操作方法是把4mL懸浮于培養(yǎng)基的原生質(zhì)體滴

7、加的組成為1.5%的纖維素酶R一10(YakuhHonshaCo.Ltd.,到直徑60mm的培養(yǎng)皿中,Parafilm封口,在28%黑暗培Tokyo,Japan)、2%的半纖維素酶(Sigma,St.Louis,US)養(yǎng)。20d后,添加新鮮的滲透壓和激素減半的KM8P液和1.5%果膠酶Serva,Heidelberg,Germany)或者l%的離析體培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中,以稀釋再生細(xì)胞團(tuán)的密度和降低酶R—lO(YakuhHonshaCo.Ltd.,Tokyo,Japan)溶于CPW溶滲透壓促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。雙層培養(yǎng)

8、是先液,附~13mmol/LMES,9%(w/v)甘露醇,pH調(diào)整到5.6,將5mLMSB固體培養(yǎng)基融化后在培養(yǎng)皿里鋪成薄層,固用孔徑為0.22m的微孔濾膜進(jìn)行抽濾滅菌。CPW溶液化后將4mL懸浮于液體培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體添加到培2012.2#.~tttM@◎同處理的原生質(zhì)體植板率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以對(duì)照能正常分裂,養(yǎng)基中培養(yǎng)

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