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1、局部miR—126基因治療促進(jìn)小鼠缺血后肢血管新生觀察［摘要］目的：通過(guò)體外構(gòu)建重組腺病毒miR-126,應(yīng)用于小鼠缺血后肢腓腸肌局部治療，觀察miR-126對(duì)缺血局部具有促血管新生作用。方法：重組腺病毒miR-126包裝、純化、滴度的鑒定；C57小鼠隨機(jī)分為A組（C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組）、B組（空病毒C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組）、C組（重組腺病毒miR-126C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組）三組，制作小鼠缺血后肢模型，術(shù)后即刻將重組腺病毒miR-126和腺病毒各50n1局部注射于小鼠缺血左后肢腓腸肌。
2、分別于3、7、14天各組（3只）取左后肢腓腸肌做HE染色、CD31免疫組化染色、westernblot檢測(cè)Akt、ERK1/2、pAkt、pERKl/2蛋白水平以及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)等。結(jié)果：各種檢測(cè)結(jié)果顯示C組較A、B兩組血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯，新生血管數(shù)目計(jì)數(shù)明顯增多，miR-126表達(dá)水平明顯增高，尤其在第7天升高最為明顯，以及VEGF、bFGF等介導(dǎo)的IP3和MAPK信號(hào)通路中ERK1、pERKl.AKT和pAKT蛋白水平表達(dá)明顯增高。結(jié)論：miR-126局部應(yīng)用于缺血后肢，通過(guò)激活A(yù)kt、
3、ERK1/2的相關(guān)通路，促進(jìn)血管新生，利于缺血后肢功能恢復(fù)。［關(guān)鍵詞］miR-126；缺血后肢；血管新生;Akt；ERK1/2；［中圖分類號(hào)1R318［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A［文章編號(hào)11008-6455（2012）10-0-0microRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約19-25個(gè)核昔酸的內(nèi)源性微小RNA,通過(guò)與靶mRNA的5'或3'端的非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合而使靶mRNA翻譯抑制或降解[1]。miR-126位于染色體9q34.3的宿主基因Egfl7（上皮生長(zhǎng)因子-7）[2],在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生
4、物功能的諸多方面，包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞骨架的形成、毛細(xì)血管網(wǎng)的穩(wěn)定以及細(xì)胞的存活等等，表明它是活體中維持功能性血管結(jié)構(gòu)的前提，對(duì)血管新生起著至關(guān)重要的作用，展示了良好的應(yīng)用前景[3-4]o本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外構(gòu)建重組腺病毒miR-126,局部應(yīng)用于小鼠缺血后肢，觀察其在局部表達(dá)情況的變化，以及促缺血局部血管新生的作用，從而及早、有效的促進(jìn)缺血后肢功能的恢復(fù)情況，探索miR-126基因治療在臨床上應(yīng)用的可行性。1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57小鼠，雌性，12周，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2儀
5、器：顯微外科手術(shù)器械、顯微外科顯微鏡、酶標(biāo)儀、電泳電源、電泳器材、轉(zhuǎn)膜電源、半干轉(zhuǎn)器材、滾筒架、發(fā)光儀、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP）、水平電泳槽、超凈工作臺(tái)、干燥消毒烤箱、紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)。1.3試劑：CD31抗體（Abeam）、二抗（Elvision法）、DAB顯色液、裂解液、ERK1/2抗體、、AKT抗體、pERKl/2抗體、pAKT抗體、轉(zhuǎn)膜液、發(fā)光液（SantaCruz）.麗春紅染料、封閉液、NC膜、電泳液、SDS凝膠試劑、GADPH、RT-PCR
6、引物合成（ABI,北京）、RNasin（Promega,美國(guó)）、M-MLV（Promega,美國(guó)）、SYBRRPremixExTaqTM（TaKaRa,日本）。2方法2.1重組腺病毒miRNA-126包裝、純化、滴度的鑒定:根據(jù)mus-mir-126的基因信息，設(shè)計(jì)上、下游引物如下：以小鼠基因組DNA為模板擴(kuò)增mus-mir-126基因；全基因合成mus-mir-126基因至PES載體上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5CMV-IRES-GFP載體上；質(zhì)粒擴(kuò)增、鑒定及線性化；重組腺
7、病毒的包裝；用滴定法測(cè)定重組腺病毒滴度。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：C57小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只:A組、C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組；B組、空病毒C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組；C組、重組腺病毒miRNA-126C57左側(cè)缺血后肢手術(shù)組。1.3C57小鼠左后肢缺血模型的構(gòu)建：在顯微外科鏡下，小鼠左側(cè)腹股溝處暴露股動(dòng)脈深、淺支，近、遠(yuǎn)端結(jié)扎，中間離斷，縫合傷口。2.4給藥方法：空病毒組、重組腺病毒miRNA-126組用lml注射器對(duì)左后肢腓腸肌局部注射,滴度為lX1090PU/ml,各50111,按組分籠喂養(yǎng)。
8、2.5檢測(cè)指標(biāo)：2.5.1大體觀察：各組0?14天末梢血運(yùn)狀況的觀察。2.5.2組織學(xué)檢測(cè)：7天、14天分別取左后肢腓腸肌組織，進(jìn)行HE染色、血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31染色，計(jì)算血管數(shù)目、密度。2.5.2.1石蠟切片常規(guī)HE染色。2.5.2.2CD31染色(Elivision法)：選取5um厚的石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，壓力鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30min,10%山羊血清封閉液37°C溫育15min,PBS沖洗，滴加稀釋兔抗鼠CD31—抗(Abeam1：25
