rhgcsf促進(jìn)不同性別大鼠缺血后肢血管新生的作用

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1、rhGCSF促進(jìn)不同性別大鼠缺血后肢血管新生的作用：劉兵王豪夫劉冰趙宗剛王曰偉【摘要】目的觀察重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhGCSF）促進(jìn)不同性別成年大鼠缺血后肢血管新生作用。方法健康成年雄性和雌性ethodsHealthyadultmaleandfemaleicmodeloralarteriesandtheirbranches.Theratsizedtotentalgroup.SubcutaneousinjectionofrhGCSFental,andequalvolumeNStothecontrol.;theVEGFo

2、ftheadductorbyimmunohistochemistry.ResultsTheentalthanthatinthecontrol,thedifferencesbetsofthegender(P>0.05).ConclusionSubcutaneousinjectionofrhGCSFcanfacilitateangiogenesisofischemiclimb,improveischemicstatusofthelimb,theeffectsdonotshoulatingfactor,rebinant;Ang

3、iogenesisregulator;Ischemia;Rats下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥是外周動(dòng)脈阻塞性疾病中最常見的疾病，易受累的部位包括小腿脛腓動(dòng)脈、腘動(dòng)脈、股動(dòng)脈及主髂動(dòng)脈，其中股、腘動(dòng)脈發(fā)病率最高。臨床表現(xiàn)以間歇性跛行、靜息痛、難治性潰瘍等下肢缺血、壞死癥狀為特點(diǎn)。該病的治療可分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療，雖然方法較多,但都有不足之處。近年來(lái)，由于在末梢血中發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，對(duì)血管新生的概念有了新的認(rèn)識(shí),EPC和骨髓細(xì)胞移植用于血管新生療法的研究已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。應(yīng)用骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑將骨髓干細(xì)胞“驅(qū)趕”到外周血

4、，增加外周血EPC的數(shù)量，可達(dá)到自體干細(xì)胞移植治療缺血性疾病的目的。已有研究證實(shí)，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGCSF)作為一種常用的骨髓動(dòng)員劑，可以顯著刺激骨髓造血，提高外周血干細(xì)胞數(shù)量。但對(duì)于實(shí)驗(yàn)個(gè)體的性別、年齡、體質(zhì)量等因素是否能影響骨髓造血及缺血肢體血管新生還沒有深入的研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)制作動(dòng)物肢體缺血模型，應(yīng)用rhGCSF刺激骨髓造血，增加大鼠外周血干細(xì)胞的數(shù)量，觀察rhGCSF是否可促進(jìn)缺血肢體新生血管的生成，以及其作用是否存在性別差異。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及制劑實(shí)驗(yàn)選用3～4月齡雄性agingSyst

5、em(V1.6)圖像分析系統(tǒng)由青島市市立醫(yī)院病理科提供。1.2大鼠下肢缺血模型的制備大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。經(jīng)左側(cè)腹股溝韌帶中點(diǎn)作一長(zhǎng)約1.0～1.5cm縱形皮膚切口，游離股動(dòng)脈，在股動(dòng)脈起始處,用1號(hào)絲線結(jié)扎并切斷股動(dòng)脈的分支，制成大鼠后肢缺血模型。成模后雄性大鼠和雌性大鼠各隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。1.3給藥及一般情況觀察大鼠后肢缺血模型制備成功3h后，各組按以下步驟給藥：實(shí)驗(yàn)組給予10μg/kg的rhGCSF皮下注射，連續(xù)5d。對(duì)照組按實(shí)驗(yàn)組的給藥方法給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)開始后，每天

6、觀察各組大鼠的一般狀況，如生命體征、飲食、切口愈合情況、毛發(fā)有無(wú)脫落及運(yùn)動(dòng)情況等。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在術(shù)前和術(shù)后第5天各測(cè)血常規(guī)1次。1.4組織切片和微血管密度測(cè)量術(shù)后4周處死大鼠，取左后肢內(nèi)收肌中段肌肉組織1.0cm×0.5cm×0.3cm大小,用甲醛固定，石蠟包埋，行肌肉橫斷面切片，片厚5μm，連切10張。取第2張和第10張行蘇木精伊紅染色，使用圖像分析系統(tǒng)在400倍視野下對(duì)切片進(jìn)行血管密度計(jì)數(shù)。1.5VEGF陽(yáng)性表達(dá)血管數(shù)檢測(cè)取石蠟包埋的內(nèi)收肌標(biāo)本，行肌肉橫斷面切片，片厚5μm。按Elivision二步法脫蠟，磷酸鹽緩沖液沖

7、洗后滴加一抗，25℃孵育1h。再滴加二抗，孵育50min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水后中性樹膠封片。在400倍視野下，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，該毛細(xì)血管即為VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管。每一標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，用圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)VEGF陽(yáng)性表達(dá)的血管數(shù)，取其平均值。1.6統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組內(nèi)實(shí)驗(yàn)前后比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)，雄性實(shí)驗(yàn)組和雄性對(duì)照組、雌性實(shí)驗(yàn)組和雌性對(duì)照組、雄性實(shí)驗(yàn)組和雌性實(shí)驗(yàn)組之間比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1大體觀察雄性實(shí)驗(yàn)組大鼠因麻

8、醉意外死亡1只，余者均存活。在觀察期間各組大鼠均未見左后肢缺血壞死。術(shù)后3d，雄性對(duì)照組有1只大鼠手術(shù)切口出現(xiàn)0.5cm×0.5cm大小潰爛。雌性對(duì)照組大鼠出現(xiàn)跛行2只，其余大鼠均未出現(xiàn)跛行或潰瘍。對(duì)照組大鼠左后肢毛發(fā)脫落多于實(shí)驗(yàn)組大鼠。2.2血常規(guī)情況實(shí)驗(yàn)組大