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《消癌平逆轉(zhuǎn)厄洛替尼非小細胞肺癌耐藥的作用機制研究.pdf》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、浙江中醫(yī)雜志2014年7月第49卷第7期【實驗研究】消癌平逆轉(zhuǎn)厄洛替尼非小細胞肺癌耐藥的作用機制研究葛淑瑜陳建張家建陳永利1浙江省立同德醫(yī)院浙江杭州3100122浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院浙江杭州310003關鍵詞消癌平非小細胞肺癌厄洛替尼耐藥逆轉(zhuǎn)機制肺癌是我國發(fā)病率和死亡率居于首位的惡性腫細胞培養(yǎng)于含1O新生牛血清、100U/ml青霉素和瘤,其中非小細胞肺癌(NSCLC)占了85。酪氨酸激100g/m1.鏈霉素的RPMI一1640培養(yǎng)液中,37℃、5酶抑制劑(TKI)的出現(xiàn)為NSCLC治療帶來了新的希CO培
2、養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),2~3天傳代1次,待三代后穩(wěn)望,但獲得性耐藥是制約TKI的主要問題。研究表明定,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。TKI的獲得性耐藥可能與細胞表皮生長因子受體1.3消癌平非細胞毒劑量摸索:取對數(shù)生長期的(EGFR)T790M二次突變以及C—met基因擴增有PC9/G2細胞(2×10/ml,10Ol/孔)接種于96孔板關[】_3l,但針對上述機制所采取的治療方法,如c-Met內(nèi),由低到高濃度分別加入消癌平1、5、lO、20、40mg/抑制劑、不可逆EGFR抑制劑等雖然均有一定逆轉(zhuǎn)ml,以及陰性對照組。每
3、個濃度設3個平行復孔,并設TKI作用,但不可避免地會伴隨著毒副作用,或者再次陰性對照組,分別共同孵育24h、48h、72h后,更換新鮮耐藥的發(fā)生。中藥聯(lián)合靶向藥物治療NSCLC在臨床培養(yǎng)液,每孔加人MTT(Smg/L)2Ol,繼續(xù)培養(yǎng)4h,低上顯示了可喜的苗頭。消癌平注射液是中藥通關藤的溫離心(500r/min,10min),棄上清液,可見藍紫色結(jié)精提取物,生長在我國云南、貴州、廣東等山區(qū),其味晶,加入DMSO100gl,搖勻,振蕩10min,在酶標儀測苦、性微寒?,F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn),消癌平聯(lián)合化療可定490
4、nm處的吸光度OD。抑制率計算公式:(1一OD以提高晚期NSCLC患者的療效,并且能有效抑制人肺實驗組/OD對照組)×100。擬合消癌平劑量濃度一腺癌細胞的增殖并活化Caspase一3誘導細胞凋亡l4]。抑制率曲線,分別計算Ic。和IC。值,并認為Ic。是消但在逆轉(zhuǎn)TKI非小細胞肺癌耐藥方面尚無報道。本研癌平非細胞毒劑量,作為消癌平后續(xù)實驗工作濃度究觀察消癌平對厄洛替尼耐藥NSCLC細胞株PC9/上限。G2耐藥性的影響,并進一步明確消癌平逆轉(zhuǎn)PC9/G21.4消癌平逆轉(zhuǎn)厄洛替尼PC9/G2耐藥考察:將對數(shù)耐藥
5、的作用機制。生長期PC9/G2細胞用含10小牛血清的RPMI-16401材料和方法培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為2×10/ml。取2塊96孔板,先1.1主要試劑與材料:消癌平注射液(20ml/支)購自加入無毒性劑量消癌平30min后,由低到高濃度加入南京圣和藥業(yè)有限公司;厄洛替尼購自武漢遠成共創(chuàng)厄洛替尼0.O01、0.01、0.1、1、10、100~mol/L,每個濃科技有限公司,以DMSO助溶為1mmol/L濃度保存度設3個平行復孑L;同時設只加入厄洛替尼(濃度梯度待用;PI3K抑制劑Wortmannin購自上海葉舟生
6、物科同上)的陽性對照組;以及加入生理鹽水的陰性對照技有限公司,以DMSO助溶為10nM濃度保存待用。組?!拷M均進行藥物孵育,其余方法均與1.3相同,用四氮甲唑藍(MTT)為SERVA公司產(chǎn)品;RNA提取試酶標儀檢測OD值(490nm吸收值)。細胞存活率計算劑盒為Omega公司產(chǎn)品;cDNA合成試劑盒為公式:OD實驗組/OD對照組×100Promega公司產(chǎn)品;PrimeScriptRT—PCRKit為大連1.5RT—PCR法測定PI3KmRNA表達:PC9/G2細寶生物公司產(chǎn)品;RPMI一1640培養(yǎng)基為G
7、IBCOBRL公胞分別經(jīng)不同濃度消癌平(PBS、1、5、10mg/m1)或司產(chǎn)品;新生牛血清為杭州四季青產(chǎn)品。高速低溫離PI3K抑制劑Wortmannin(5nM)和PBS處理24h后收心機為Beckman公司產(chǎn)品。水套式CO培養(yǎng)箱為長集細胞,Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以沙長棉應用技術研究所產(chǎn)品。酶標儀為BIORAD公cDNA為模板,進行PI3K基因和內(nèi)參基因GAPDH擴司生產(chǎn)。增。反轉(zhuǎn)錄反應條件為42℃20min,95℃2min;PCR1.2細胞來源和培養(yǎng):厄洛替尼耐藥NSCLC細胞系
8、反應條件為94℃1min,55℃2min,72℃2min,3O次Pc9/G2購自同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院腫瘤科L6],循環(huán)。內(nèi)參基因GAPDH引物序列為:上游5,-一浙江中醫(yī)雜志2014年7月第49卷第7期GAGTCAACGGATTTGGTCGT一3’,下游5’一TT—3.8)VS(53±2.1)、(10±0.2%)V8(12±0.1)。GATTTTGGAGGGATCTCG-3’。目標基因PI3K