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1、山東畜牧獸醫(yī)2014年第35卷鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定馮永勝衣服德(山東省青島市畜牧獸醫(yī)研究所266100)陳正平(青島市嶗山區(qū)沙子口街道畜牧獸醫(yī)站)中圖分類號：$858．32文獻標識碼：B文章編號：1007-1733(2014)06-0054-02鴨病毒性肝炎(DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)引起雛鴨按Reed．Muench法計算ELD50。的一種以肝臟出血性炎癥為特征的急性烈性傳染病。該1．7動物回歸試驗選擇50只4日齡雛鴨，隨機分為5病在許多國家廣泛傳播，使養(yǎng)鴨業(yè)遭受重大損失。近年組，每組10只。將病料接種雛鴨，腿部肌肉注射
2、，O．2ml／來，在許多地區(qū)時有發(fā)生，嚴重影響了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。只。對照組雛鴨注射相同劑量的生理鹽水。觀察并記錄為了有效控制該病的發(fā)生和流行，筆者從患病鴨群中分雛鴨的臨床表現(xiàn)和死亡情況。離了DHV分離株，并進行了初步的鑒定。2結果1材料與方法2．1病毒分離病料接種在l1～12日齡鴨胚傳5代后，基1．1材料DHVI型標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察本穩(wěn)定在48～96h胚胎死亡，死亡率可達90％以上(鴨胚傳所：9-11曰齡SPF雞胚購山東省家禽研究所；11～12日齡代死亡情況見表1)。死亡鴨胚發(fā)育受阻，全身皮膚和皮非免疫鴨胚購自濰坊某孵化場
3、；4日齡雛鴨購自濰坊某種下充血和出血，腹部和后肢嚴重水腫，肝呈黃紅色，腫鴨場。大，并有針頭大小出血點和壞死灶。該病毒株對鴨胚1．2病料的采集將DVH病鴨無菌采集肝臟。接種普通ELD50按照毒力測定方法測定結果為10。瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，分別在37℃恒溫箱培養(yǎng)表1DHV分離株各代次鴨胚不同死亡時間的死亡率24h。觀察有無細菌生長。將病料研碎，與滅菌生理鹽水代鴨胚墮墅圭墮48-96h總死次數(shù)(枚)25-4849~72739697120121168死亡率亡率按照l：5混勻，然后加入終濃度為1000U／ml的青霉素和鏈Fl2O65405
4、5％8O％霉素，于4。C冰箱中過夜。3000fmin離心10min，取上清F219773073％89．5％液，．2O℃保存?zhèn)溆谩?O870275％85％1．3病毒的分離與培養(yǎng)將病料上清液經(jīng)尿囊腔接種Fd18781083％88．9％F520【180095％95％11-12日齡非免疫鴨胚各20只(0．2ml／枚)，于37．5℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。棄去24h內(nèi)死亡的鴨胚，以后每隔12h觀察1次，收2．2R1PCR檢測結果DVH病鴨肝臟中提取RNA，采用RT-PCR方法擴增出O．5kbp大小的片段，與預期大小一集死亡鴨胚的尿囊液，觀察鴨胚病變。按同樣
5、的方法，致。采用RT-PCR方法檢測鴨胚尿囊液中是否有禽呼腸孤將病毒連續(xù)盲傳5代。病毒、禽淋巴細胞白血病病毒等，結果均為陰性。接種1．4RT-PCR檢測參照GenBank中發(fā)表的DHVVP1基因雞胚比正常雞胚小，孵至21日齡后仍不能出殼而出現(xiàn)死序列設計1對引物，引物由上海捷瑞公司合成。按照胚。所分離的病毒不能凝集雞紅細胞，判定為DHV單一TRIzol試~lJ(Invitrogen公司1說明，用SDS．蛋白酶K法提取感染。病毒RNA。反轉(zhuǎn)錄后，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴2．3分離病毒的血清學特性將DHV分離株與I型DHV標增。取10
6、．01．tl反應產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖中進行電泳分析。準陽性血清孵育，接種鴨胚。中和試驗結果顯示，分離1．5血清學特性觀察取一定量的DHV分離株按1：2、株1：2稀釋液被DHV陽性血清中和后，24～144h的鴨胚死1：20、1：200和1：2000倍稀釋，加入等體積的I型DHV標準亡率為100％，1：2000稀釋液被DHV陽性血清中和后，陽性血清，并加入終濃度均為100U／ml的青霉素和鏈霉24～l44h的鴨胚死亡率分別為80％，這株病毒與I型DHV陽素。于37"C溫箱作用60min后，接種11～12日齡鴨胚各1O性血清的交叉保護率為
7、20％。枚(0．2ml／只)。另取5枚鴨胚經(jīng)尿囊腔接種0．1mlDHV病毒表2I型DHv陽性血清對DHV分離株的交叉保護率液作為陽性對照，另取5枚不接種作為空白對照。相同條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察7d。1．6毒力測定將DHV分離株進行1：1×10、1：1×10、1：l×10、1：1×10、1：1×10稀釋，接種11～12日齡鴨胚各2．4分離株對雛鴨的致病性將分離株按照0．2ml／只接1O枚(0．2ml／只)。同時設空白對照組。接種后，棄去24h內(nèi)種雛鴨，其對雛鴨的致死率為30％～60％。雛鴨在接種后死亡的鴨胚，每天觀察鴨胚的死亡情況，連續(xù)觀
8、察6d。2-3d達到死亡高峰，表現(xiàn)為突然發(fā)病、不食，死亡快，542014年第6期(總第209疾病防治淺談試驗中豚鼠的飼養(yǎng)及肺炎的防治李成功金凡茂陳壯志趙海蓉巫秀美術(大理學院云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室云南大理671
