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《兔出血癥病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、動物醫(yī)學(xué)進展。2013，34(12)：69—73ProgressinVeterinaryMedicine兔出血癥病毒實時熒光定量RT—PCR檢測方法的建立肖躍強，謝金文，徐二丹。，沈志強，丁壯(1．吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春130062；2．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；3．泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271016)摘要：為建立一種敏感、特異、簡便的兔出血癥病毒(RHDV)檢測方法，根據(jù)GenBank中公布的RHDV全基因組序列保守區(qū)域設(shè)計了2對引物，篩選了其中1對建立并優(yōu)化了PCR條件，擴增產(chǎn)物為33
2、1bp，并基于此建立了SYBRGreenI熒光染料real—timeRT—PCR檢測方法。通過敏感性、特異性、標(biāo)準曲線建立等表明，該方法可檢出10以上拷貝數(shù)的模板，只在RHDV有特異性擴增，標(biāo)準曲線線性相關(guān)性好。實際應(yīng)用結(jié)果顯示，該方法對疑似RHDV病料檢測的陽性率為74．8，而普通RT-PCR方法檢測的陽性率為65．5。該方法的建立為開展該病的診斷、疫苗制備質(zhì)控等提供了有效的技術(shù)保障。關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)；建立中圖分類號：$852．659．6；Q789文獻標(biāo)識碼：A文章編號：100
3、7—5038(2013)12—0069—05兔病毒性出血癥(Rabbithaemorrhagicdis—性不高，有些雖然敏感性高，但成本較高。基于ease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbithaemor—SYBRGreen工熒光染料的實時熒光定量PCR診rhagicdiseasevirus，RHDV)引起的一種嚴重危害斷方法相對普通PCR能夠提高敏感性，而且比養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展與野兔生態(tài)系統(tǒng)平衡的急性傳染TaqMan探針熒光定量PCR降低了成本，因此具有病，其特征為發(fā)病快、病死率高。該病于1984年春良好的應(yīng)用前景。
4、目前該方法已經(jīng)成為疫病診斷和在我國江蘇、無錫首先暴發(fā)口]，并迅速傳播至國內(nèi)各開展免疫學(xué)、病毒分子生物學(xué)、病毒致病機制、病原省市及韓國、朝鮮等周邊國家，墨西哥等國家由于和與宿主細胞相互作用等領(lǐng)域研究的一種重要的工中國兔產(chǎn)品貿(mào)易也導(dǎo)致發(fā)生該病。之后，在歐洲，該具，并且該方法容易標(biāo)準化。因此，本文建立了病首先在意大利暴發(fā)，然后前蘇聯(lián)、匈牙利、波蘭、德RHDVreal—timePCR檢測方法，并開展了臨床應(yīng)國、捷克、西班牙、法國、比利時等國也發(fā)生流行]。用，與常規(guī)PCR方法相比具有敏感性更高、檢出率由于該病發(fā)病率高，病死率高
5、達40～100，給養(yǎng)更高等特點。兔業(yè)造成嚴重的損失。國內(nèi)外獸醫(yī)工作者在病原1材料與方法學(xué)、臨床診斷、預(yù)防等方面都開展了廣泛的研究工1．1材料作，取得了很大進展。目前，兔病毒性出血癥的診1．1．1病毒兔出血癥病毒、兔輪狀病毒和兔水泡斷，世界動物衛(wèi)生組織(OfficeInternationalDes性口炎病毒，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存并提Epizooties，OIE)推薦使用血凝(hemagglutination，供。HA)試驗、電鏡觀察、RT—PCR(reversetranscrip—1．1．2主要試劑2×Powe
6、rTaqPCRMastertion-polymerasechainreaction)、Westernblot、免疫Mix、dNTPs、rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、染色、原位雜交、動物回歸試驗等方法進行實驗室診RNA酶抑制劑，TaKaRa公司產(chǎn)品；2×SYBR斷，同樣，血凝抑制(hemagglutinationinhibition，Greenreal—timePCRMasterMix，ToYoBo公司產(chǎn)HI)試驗、瓊脂擴散試驗(agar—gelimmunodifusion，品；DNA純化回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取
7、試劑盒、蛋AGP)]、對流免疫電泳[4]、SPA菌體免疫掃描電鏡白酶K、Trizol試劑，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)l6]、免疫電鏡捕獲限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶M—MLV，北京百泰克生物技雙裝飾法]、TaqMan探針熒光定量檢測方法等術(shù)有限公司產(chǎn)品。也用于實驗室診斷。但是，這些方法中，有些需要繁1．1_3引物設(shè)計及合成根據(jù)GenBank中公布的兔瑣的樣品處理過程，耗時費力，有些簡單實用但敏感出血癥病毒全基因組進行分析，應(yīng)用PrimerPremier收稿日期：2013—10-20基金項目：
8、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室開放基金課題作者簡介：肖躍強(1978一)，男，山東臨清人，助理研究員，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者肖躍強等：兔出血癥病毒實時熒光定量RT—PCR檢測方法的建立712．3Real—timePCR進行梯度稀釋。由圖5可知，稀釋所得的樣品在拷采用優(yōu)化的反應(yīng)條件及程序進行real
