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《非洲馬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、動物醫(yī)學進展。2013，34(12)：1卜16ProgressinVeterinaryMedicine非洲馬瘟病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立趙文華，楊仕標，李富祥(云南省畜牧獸醫(yī)科學院國家外來動物疫病診斷實驗室云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明650224)摘要：非洲馬瘟病毒(AHsV)為雙股RNA病毒，能感染所有馬科動物。為建立一種AHSV快速檢測方法，根據(jù)GenBank及作者所測AHSV9個血清型VP7一ORF全長核苷酸序列，設計一對位于AHSV基因組S7片段的特異引物
2、，然后進行熒光定量檢測。經(jīng)試驗，證實該對引物對9種血清型的AHSVRNA均有特異性擴增，能檢出特異熒光信號，而對與AHsV同屬的藍舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血癥病毒(EHDV)及正常馬淋巴組織和陰性對照均無擴增，無有效熒光信號可檢出。以國家外來動物疫病診斷實驗室已構(gòu)建好的AHSV9型pMD18-T—VP7質(zhì)粒為標準品可建立良好的標準曲線，實現(xiàn)對檢測樣本的實時定量。本研究建立了模板預變性結(jié)合“三步”法敏感特異的AHsV實時熒光定量RT-PCR快速檢測方法，檢測靈敏度可達10拷貝／vL。關(guān)鍵詞：非
3、洲馬瘟病毒；血清型；SYBRGreenI；實時熒光定量RT-PCR中圖分類號：$852．651；Q786文獻標識碼：A文章編號：1007—5038(2013)12—0011-06非洲馬瘟(Africanhorsesickness，AHS)是由VP7蛋白基因S7區(qū)段設計一對特異性引物，用實時呼腸病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的熒光定量RT-PCR方法對AHSV的快速定性和定非洲馬瘟病毒(AHsV)引起的感染所有馬科動物的量檢測。一種非接觸性病毒性傳染病。本病以呼吸系統(tǒng)
4、和循1材料與方法環(huán)系統(tǒng)的病理變化為特征，目前發(fā)現(xiàn)至少有2種庫1．1材料蠓屬昆蟲可傳播該病，至少存在9個血清型。AHS1．1．1血清及病毒AHSV9個血清型的滅活凍在非洲的撒哈拉地區(qū)呈地方性流行，也曾在非洲北干疫苗均由Onderstepoort(SouthAfrica)引進，詳部、中東、歐洲發(fā)生，該病的發(fā)生呈季節(jié)性。易感動細情況如表1所示。藍舌病病毒(Bluetonguevi—物感染后的病死率最高可達95，一旦暴發(fā)會給養(yǎng)rUS，BTV)為本實驗室保存，鹿流行性出血癥病毒馬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，因此世
5、界動物衛(wèi)生組織(Epizootichemorrhagicdiseasevirusofdeer，(OIE)將其列為必須通報的動物疫病，我國將其列EHDV)RNA為云南省出入境檢驗檢疫局提供，凍為一類動物疫病]。存的正常馬淋巴組織為哈爾濱畜牧獸醫(yī)科學研究所鑒于該病的嚴重性和對養(yǎng)馬業(yè)的毀滅性打擊，饋贈。在國家及國際間流動的馬匹必須要進行嚴格的動物1．1．2試劑、耗材及儀器TaKaRaMiniBestViral檢疫，尤其是在地方流行區(qū)及無該疫病區(qū)域之間流RNA／DNAExtractionkit用于病毒RN
6、A的抽提，動的馬匹更應該進行該病的檢疫。國際賽馬活動的OnestepSYBRPrimescriptRT—PCRkit用于普及以及馬胚質(zhì)資源的流動，邊境地區(qū)非法走私馬SYBR熒光定量RT-PCR，Goldview核酸染色劑均匹活動的存在，全球氣候變暖引發(fā)生態(tài)系統(tǒng)改變進為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR而使病原微生物生態(tài)變化等，種種因素皆可能造成反應管及ABI7500Fast熒光定量PCR儀為ABIAHS在非地方流行區(qū)域的暴發(fā)流行]。我國目前公司產(chǎn)品；BlowestAgarose為上海生
7、工生物工程雖為AHS無疫區(qū)，但隨時面臨該外來病被引入的風技術(shù)服務有限公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇、無水乙醇等險，因此有必要對該類外來動物疫病進行相應檢測、其他試劑均為分析純試劑。監(jiān)測技術(shù)的貯備。本研究在已建立AHSV群、型特異RT-PCR檢測方法的基礎上[4]，選擇保守的收稿日期：2013—03—26基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903037)作者簡介：趙文華(1974一)，女，山東高唐人，副研究員，主要從事動物分子病毒學研究。*通訊作者12動物醫(yī)學進展2013年第34卷第12期(總第24
8、6期)1．2方法溶解，引物貯存濃度為100pmol／t~L，工作濃度為1．2．1引物根據(jù)GenBank及作者所測序列，設20．0pmol／t~L。計特異性引物對。引物情況如下表2所示，引物由1．2．2病毒基因組RNA提取按照RNA提取試寶生物工程(大連)有限公司合成，為HPLC級別。劑盒說明書操作，簡述如下：先用滅菌水按要求溶將合成的引物干粉用無RNase酶的PCR級水進行解非洲馬瘟滅活疫苗凍干粉，然后取20O肚L待用。表2SYBRGreenI熒光定量RT—PCR引物Table2T
