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1、種植體骨磨片組織學(xué)效果對(duì)比 目前，對(duì)種植體周圍骨愈合和骨結(jié)合的研究方法主要采用骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析方法。而種植體與其周圍骨組織的結(jié)合狀態(tài)、成骨效果以及骨細(xì)胞學(xué)研究可通過(guò)組織學(xué)方法觀察、研究和分析。不脫鈣種植體骨磨片能完整顯示種植體與骨結(jié)合的界面和礦化結(jié)構(gòu)，不同磨片染色后，骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)顯示不同。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)3種不同特殊染色方法進(jìn)行種植體骨磨片染色，對(duì)組織顯示效果進(jìn)行比較分析，探討種植體骨組織形態(tài)學(xué)的研究方法，為種植體骨形態(tài)計(jì)量參數(shù)的研究提供依據(jù)?！ ?材料和方法 1．1種植體骨組織取材與預(yù)處理 在Beagle犬脛骨植入12枚BLB純鈦圓柱狀種植體(北京萊頓生物材料有限公
2、司)，8周后處死動(dòng)物，制取種植體骨組織標(biāo)本，將其固定于甲醛溶液48h，酒精逐級(jí)脫水，氯仿透明，甲基丙烯酸甲酯與鄰苯二甲酸二丁酯混合液浸潤(rùn)、包埋［1］?！ ?．2種植體骨磨片的制作 將修整好的包埋塊固定于EXAKT300CP切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))切取200～300μm厚的切片，然后用EXAKT400CS磨片機(jī)(Leica公司，德國(guó))，分別以粒徑18μm(800目)、11．5μm(1200目)、5．2μm(2500目)水砂紙將切片磨至10～15μm厚，最后以粒徑3．2μm(4000目)水砂紙拋光切片組織表面至完全無(wú)磨痕。每個(gè)標(biāo)本制作3張磨片，分別采用3種不同染色方
3、法進(jìn)行染色?！ ?．3配制染色液 1．3．1亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色液［2］亞甲基藍(lán)染液包括溶液A和溶液B。溶液A:亞甲基藍(lán)1g，蒸餾水75mL;溶液B:高錳酸鉀1．5g，蒸餾水75mL。將溶液A、B混合，100℃水浴至沉淀溶解后冷卻至室溫過(guò)濾。苦味酸酸性品紅染液:冰醋酸0．5mL，酸性品紅0．25g，甘油10mL，蒸餾水90mL，加苦味酸至飽和?！ ?．3．2Goldner’s三色染色液［3］①Weigert’s鐵蘇木素液由溶液A和溶液B混合而成。溶液A:1g蘇木素溶于100mL95%乙醇溶液;溶液B:1．16g三氯化鐵、100mL蒸餾水、1mL鹽酸混合。②麗春紅－酸
4、性品紅液:0．4g麗春紅、0．1g酸性品紅、0．6mL冰醋酸與300mL蒸餾水混合。③磷鎢酸－橙黃G液:15g磷鎢酸與300mL蒸餾水混合后，加入6g橙黃G混勻。④亮綠液:0．9g亮綠、0．6mL冰醋酸、300mL蒸餾水混合?！ ?．3．3甲苯胺藍(lán)染色液①檸檬酸(枸椽酸)磷酸緩沖液由溶液A、B混合而成。溶液A:0．1mol/L檸檬酸溶液，由檸檬酸20．01g加蒸餾水至1000mL配制而成;溶液B:0．2mol/L磷酸氫二鈉溶液，由十二水磷酸氫二鈉71．6g加蒸餾水至100mL配制而成;取溶液A32．3mL、溶液B17．7mL，混合即成pH值為3．8的緩沖液。②甲苯胺藍(lán)液
5、:甲苯胺藍(lán)2．0g溶于100mL緩沖液，溶解后過(guò)濾，用1mol/LNaOH調(diào)pH值至3．8。 1．4磨片染色 1．4．1亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法［4］將磨片置于亞甲基藍(lán)染液染色，60℃水浴15min，濾紙吸干染液;60℃蒸溜水漂洗，干燥;酸性品紅染液染色5min，濾紙吸干染液;95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片?！ ?．4．2Goldner’s三色法［4］將磨片脫塑至水，Weigert’s鐵蘇木素液15min，蒸溜水漂洗1次，流水沖洗15min，蒸餾水漂洗1次，麗春紅－酸性品紅液15min，1%醋酸液漂洗2次，磷鎢酸－桔黃G液8min，1%醋酸液漂洗2次
6、，亮綠液15min，1%醋酸液漂洗2次，70%乙醇漂洗1次，100%乙醇漂洗2次，二甲苯透明，樹(shù)脂封片?！ ?．4．3甲苯胺藍(lán)染色法將磨片脫塑至水，甲苯胺藍(lán)染色液10min，檸檬酸(枸椽酸)磷酸緩沖液沖洗2次，1min/次，吸干磨片水分，乙醇脫水2次，1min/次，二甲苯透明2次，1min/次，樹(shù)脂封片。 1．5組織學(xué)觀察 將3種特殊染色法染色后的磨片置于倒置相差顯微鏡下，觀察并采集圖像?！ ?結(jié)果 2．1亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色法 亞甲基藍(lán)－酸性品紅染色后種植體骨結(jié)合界面清晰，種植體表面羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層為紫紅色，成骨細(xì)胞及細(xì)胞
7、核、類骨質(zhì)顯示清晰，成骨細(xì)胞核染成深藍(lán)色，細(xì)胞基質(zhì)染成淡藍(lán)色，類骨質(zhì)為紫灰色。新骨組織為深紅色，與種植體骨界面分界清晰，原礦化骨組織為紅色，與新生骨分界較模糊(圖1A)?！ ?．2Goldner’s三色法 Goldner’s三色法染色后種植體骨結(jié)合界面清晰，種植體表面HA涂層為亮綠色，新生骨為深綠色，原礦化骨為綠色，二者界限清楚，成骨細(xì)胞為橘黃色，著色淺，不能分辨細(xì)胞核及其基質(zhì)，類骨質(zhì)染成橘紅色，成骨細(xì)胞與類骨質(zhì)分界模糊(圖1B)?！ ?．3甲苯胺藍(lán)染色法 甲苯胺藍(lán)染色顯示種植體骨結(jié)合界面較模糊，種植體表面HA涂層為藍(lán)紫色，新生骨為深
