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《抗Trastuzumab單克隆抗體制備及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、按摩與康復醫(yī)學2011．6(中)ChineseManipulation&RehabilitationMediciqne2011，No．5355抗Trastuzumab單克隆抗體制備及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立王延濤，趙喜紅。王銳(1．黑龍江哈爾濱哈藥集團生物工程有限公司哈爾濱1500252。黑龍江哈爾濱哈藥集團技術中心哈爾濱150025)摘要：本研究利用曲妥珠單抗(Trastu~umah)4次腹腔免疫6—8周齡BALB／e雌性小鼠。通過淋巴細胞雜交瘤技術、間接ELlSA篩選技術及腹水制備等技術制備并獲得抗Trastuzumab單克
2、隆抗體。試驗結果表明，通過細胞融合獲得了一株能穩(wěn)定分泌抗Trastuzumab的雜交瘤細胞株A6E8，其制備的腹水單克隆抗體純化后效價為256000，該抗體屬于IgG1亞類，鏈的類型為k鏈。利用制備的單克隆抗體(McAb)建立Trastuzumab雙抗體夾心ELISA檢測方法，試驗結果顯示，該檢測方法特異性良好，不與其他抗體及蛋白發(fā)生交叉反應，所建立的Trastuzumab雙抗體夾心ELISA方法最低檢測限為1ng／mL。關鍵詞：Trastuzumab單克隆抗體雙抗體夾心ELISA藥物代謝動力學【中圖分類號]R4【文獻標識碼IA【文章編號】
3、1O08—1879(2011)06-0055—01乳腺癌是一種嚴重威脅婦女健康及生命的惡性腫瘤，其發(fā)得的單克隆抗體為IgG1亞類，輕鏈為k鏈?？贵w特異性鑒定結病率約為成年女性1_1]。曲妥珠單抗是美國FDA批準上市果顯示，該抗體能與市售曲妥珠單抗發(fā)生高親和力結合，但不與的第一個重組人源化抗HER2受體單克隆抗體，由羅氏公司生人IgG1、鼠IgG1發(fā)生交叉反應，說明其具有較好的特異性。產并于1998年10月15日首次在美國上市，它主要用于治療3．2Trastuzumab雙抗體夾心ELISA方法的確定。HER2過度表達的轉移性乳腺癌r2]。抗T
4、rastuzumab單抗的制3．2．1包被條件確定：用碳酸鹽包被液稀釋純化的Trastuzum—備和其測方法的建立為開展Trastuzumab藥物代謝動力學研究ab單抗至濃度lgg／mL，加入96孔酶標板，每孔100L，4℃包奠定了基礎。被12h；1材料3．2．2封閉條件確定：用PBST洗滌3次，拍干后，每孔加入佐劑購自SIGMA公司；Trastuzumab由哈藥集團技術中心200l5脫脂奶粉，37℃封閉1h；制備；6～8周齡Balb／c小鼠購自北京實驗動物研究中心；SP2／O3．2．3一抗?jié)舛却_定：PBST洗滌3次，拍干后，將待檢樣品進細
5、胞購自中國科學院上海生命科學研究院。行1：100倍稀釋，Trastuzumab標準品進行4倍稀釋(4000～2方法lng)，每孔加人100L，37℃孵育50min；2．1單克隆抗體的制備。用純化的曲妥珠單抗免疫5只Balb／3．2．4酶標二抗?jié)舛却_定：將HRP標記山羊抗人lgG—Fc抗c小鼠，經(jīng)過3次基礎免疫，選取效價最高(≥10000)的小鼠進行體1：5000稀釋，每孔加入100／LL，37℃孵育50min；強化免疫。3-4天后利用淋巴細胞雜交瘤技術進行細胞融合，3．2．5顯色時間確定：PBST洗滌3次，拍干，加入底物液陽性雜交瘤篩選經(jīng)過
6、3次克隆，挑選獲得的陽性雜交瘤細胞進(OPD)，室溫避光作用10min；行亞克隆建庫，陽性克隆細胞株擴大培養(yǎng)后注射Balb／e小鼠腹3．2．6終止：每孔加入5OL終止液(2MH2SO4)，輕輕振搖混腔內誘生腹水，利用親和層析方法純化所得的小鼠腹水，進行勻，測定OD492值。sDs—PAGE純度鑒定和間接ELBA測定抗體效價。3．3Trastuzumab雙抗體夾心ELISA檢測方法特異性的鑒定。2．2雙抗體夾心ELISA檢測方法建立。試驗結果顯示，檢測樣品中只有市售曲妥珠單抗出現(xiàn)強陽性反2．2．1雙抗體夾心ELISA最佳反應條件確定(方陣滴定
7、法)：應，其他均為陰性，表明此方法具有較好的特異性。結果見參考李瑞等(2005)、焦奎等(2004)方法。表1。2．2．2雙抗體夾心ELIsA方法特異性試驗：按上述ELISA步表1Trastuzumab雙抗體夾心EUSA特異性試驗結果驟對人血清、猴血清、鼠血清、西妥昔單抗及曲妥珠單抗進行檢測，以檢驗該方法的特異性。2．2．3雙抗體夾心EL1SA方法的敏感性試驗：將初濃度為4ug／mL的曲妥珠單抗連續(xù)作4倍梯度稀釋，然后按照確定的3．4雙抗體夾心ELISA方法敏感性的測定。將純化抗原的濃ELISA反應條件進行測定。根據(jù)P／N值大于2．1，陽性
8、值大于度稀釋到4ug／mL，之后連續(xù)作4倍梯度稀釋，按照確定的0．2，檢驗該方法的敏感性。EuSA反應條件進行測定，試驗結果顯示，該方法能檢測出約3結果與分析0．97ng／mL的
