牛乳鐵蛋白卵黃抗體的制備及純化方法的建立.pdf

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1、第32卷第6期Vo1．32NO．62011年11月NOV．2O11牛乳鐵蛋白卵黃抗體的制備及純化方法的建立江青東，王慧杰(鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，河南鄭州450011)[摘要]通過自制并初步純化牛乳鐵蛋白的卵黃抗體，用肌肉和皮下注射結(jié)合的方法羅曼蛋雞進行免疫來制備多克隆抗體。選用150日齡的羅曼蛋雞4只進行不同濃度的多次皮下免疫注射，采集卵黃抗體并用硫酸銨沉淀法進行抗體的初步純化，經(jīng)四次免疫后的羅曼蛋雞卵黃抗體的效價分別達到了l：32000和l：24000，并在較高水平的情況下維持兩周以上，同時經(jīng)初

2、步純化后抗體純度得到了很大提高。試驗結(jié)果顯示肌肉和皮下注射結(jié)合的方法對羅曼蛋雞進行免疫來制備多克隆抗體是可行的，同時通過硫酸銨沉淀法純化抗體可以達到試驗的需求。[關(guān)鍵詞]牛乳鐵蛋白；卵黃抗體；制備；純化[中圖分類號]$811．6[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1005—5228(2011)06—0071—031960年Groves從牛乳中分離獲得乳鐵蛋白籠，試驗El糧按照NRC(1994)蛋雞高峰日糧標(biāo)準(zhǔn)配(Iactoferrin，LF)，其分子量為70～80kD，LF廣泛制。試驗雞自由采食，自由飲水，室內(nèi)溫度為15

3、～存在于乳汁、唾液、淚液等外分泌液或血漿、中性粒25℃，光照時間為14～16h，定期觀察記錄，確保動細(xì)胞中E1,2]。LF具有多種生物學(xué)功能，如參與鐵的物健康，產(chǎn)蛋率高。轉(zhuǎn)運和吸收、抑菌效應(yīng)、調(diào)整補體活性、調(diào)節(jié)免疫系1．1．2試驗動物的分組采用隨機分組的方法分統(tǒng)、抑制炎癥、刺激淋巴細(xì)胞生長、抗病毒、防止脂肪為兩組，然后分別用0．5mg／mL和1mg／mL對兩過氧化、調(diào)整胃腸道微生物類群等多種功能[3]。因組蛋雞進行免疫。此乳鐵蛋白在國內(nèi)外日益成為人們研究的熱點。卵1．2儀器和試劑黃抗體亦稱卵黃免疫球蛋白(1gY)

4、，是母雞在體內(nèi)1．2．1試劑考馬斯亮蘭R一250、G一250、弗氏完全卵發(fā)育過程中，由血清中的lgG轉(zhuǎn)移至卵黃中形成佐劑、瓊脂粉均購自Sigma公司，牛乳鐵蛋白由河的l7]。與哺乳動物的lgG相比，lgY具有價廉易得、南農(nóng)業(yè)大學(xué)生理實驗室制備。穩(wěn)定好、產(chǎn)量高且lgY對酸、酶、溫度具有較高的穩(wěn)1．2．2儀器wH一3型微型旋渦混合儀、磁力攪拌定性等優(yōu)點。器、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高壓鍋、尤尼柯UV一2800因此，建立一套完整的多克隆抗體制備方法顯紫外可見分光光度計、DYY一6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀得十分必要，本實驗是在結(jié)合

5、前人實驗的基礎(chǔ)上摸均購自北京六一儀器廠；Sigma低溫高速離心機；凍索和建立了牛乳鐵蛋白卵黃抗體的制備及純化方干機RLPHR1—2(CHRIST)；真空泵(CHRIST)、透法，并通過實驗驗證其結(jié)果是可行的，這將為今后從析膜均購自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司。事牛乳鐵蛋白卵黃抗體的制備及純化等領(lǐng)域的研究1．3試驗方法提供理論基礎(chǔ)。1．3．1牛乳鐵蛋白抗原溶液濃度的測定測定方法用考馬斯亮蘭法¨8]。1材料和方法1．3．2乳鐵蛋白油乳苗的制備將濃度為1mg／1．1試驗動物mL的牛乳鐵蛋白抗原溶液與弗氏完全佐劑等量混1

6、．1．1試驗動物條件150日齡羅曼蛋雞4只，體勻，置于微型旋渦混合儀上使之劇烈振蕩使抗原充重2．0kg，購于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧站。試驗雞單分乳化，振蕩后，1000r／min離心1min。[收稿151期]201110-29，修回日期：2011—11-14[作者簡介]江青東(1978一)，男，河南商城人，在讀博士，講師，主要從事哺乳動物泌乳生理學(xué)研究。E—mail：Jiangqd2000@126．corn72家畜生態(tài)學(xué)報第32卷1．3．3羅曼蛋雞的免疫采用胸肌及頸部皮下多kDa12點注射法，用乳鐵蛋白油乳苗在胸肌注射4

7、個點，頸部皮下1個點，每點0．2mL。每隔兩周加強免疫一次，共加強免疫三次。1．3．4卵黃抗體(IgY)的提取每次免疫1周后取雞蛋數(shù)枚，采用簡單高效的水溶法進行分離和純化，得蛋黃約13mL／枚。蛋黃液1O倍稀釋后用鹽酸調(diào)節(jié)pH到5．0，4℃放置6h，4℃5000r／min離心1h，取上清液加入等體積的飽和硫酸鈉溶液，圖2純化IgY的SDS-PAGE分析使飽和度達到5O。4℃放置6h，離心后取其沉1．標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2．純化的卵黃抗體淀，溶于同等蛋黃體積的0．01mol／mLpH7．4Fig．2SDS-PAGEanaly

8、sisofpurifiedIgYPBS中，再加人1／2體積的飽和硫酸鈉溶液，使飽和1．Standardprotein；2．Purifiedyolkantibody度達到33，重復(fù)上一步操作；用透析膜透析，過濾價有明顯升高并能在2周內(nèi)保持在較高水平。結(jié)果滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩１砻?，可以通過多次采集全血得到所需抗體，同時乳1．3．5卵黃抗體純度的檢測將初步純化得到的鐵蛋白濃度不