胃蛋白酶原Ⅱ單抗制備及夾心ELISA的初步建立.pdf

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1、動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(4)：56—59ProgressinVeterinaryMedicine胃蛋白酶原Ⅱ單抗制備及夾心ELISA的初步建立張紅緒，孫青蕓，王繼創(chuàng)。，李恒思，張怡青，董彩文。，李玉林，劉旺根。，景建洲。，王云龍(1．河南師范大學(xué)，河南新鄉(xiāng)453007；2．河南生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450021；3．鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450021；4．鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450121)摘要：制備配對胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)單抗，建立人血清中胃蛋白酶原Ⅱ夾心ELISA檢測方法。用胃蛋白酶原Ⅱ免疫Balb／c小鼠，制備免疫脾細(xì)胞，與SP2／O融合，用HAT培養(yǎng)

2、基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，間接ELISA檢測陽性克隆，對陽性孔進(jìn)行多次單克隆化，選出效價高、分泌性能穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，制備腹水并進(jìn)行純化。進(jìn)行單抗配對，建立胃蛋白酶原Ⅱ雙抗體夾心檢測方法。獲得1D。、1C、2H、2E。等4株雜交瘤，經(jīng)配對試驗，確定1D、2H可作為夾心ELISA檢測PGII的單抗。成功制備出配對單抗，初步建立了PGII雙抗體夾心ELISA方法。關(guān)鍵詞：胃蛋白酶原；單克隆抗體；雙抗體夾心ELISA中圖分類號：$854．43文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007—5038(2012)04—0056—04胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是胃黏膜分泌的IgG，由河南省生物工程技術(shù)

3、研究中心提供；胃癌陽特異性功能酶，人胃蛋白酶原可根據(jù)生化和免疫原性血清，由鄭州市腫瘤醫(yī)院提供；胃蛋白酶原Ⅱ檢測性特征分為2種不同的胃蛋白酶原亞群口]。在瓊脂試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，購于北京美康生物技術(shù)研究糖凝膠電泳下，胃蛋白酶原的遷移率由快到慢分為中心；羊抗鼠酶標(biāo)二抗(HRP—IgG1、HRP—IgG2a、PG1～PG77種同工酶，其中PG1～PG5有共同的HRP—IgG2b、HRP—IgG3、HRP—IgA及HRP—IgM)，免疫原性，合稱PGI(又稱PGA)；PG6～PG7遷移購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。速度較慢，合稱PGII(又稱PGC)。PGI是胃體黏1．2方法膜主細(xì)

4、胞分泌，除主細(xì)胞分泌外，幽門腺和十二指腸1．2．1小鼠免疫取8周齡～1O周齡Babl／c雌性也分泌PGlI_2j。小鼠3只，將抗原和福氏完全佐劑(cFA)等體積混合，腹腔注射，首次免疫2周后二次免疫，用福氏不胃癌是全球高死亡率的第二大疾病，嚴(yán)重威脅完全佐劑(IFA)與抗原等體積混合。每次100著人類的健康。對胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療可明顯延g／只。二次免疫后10d左右進(jìn)行抗體效價檢測，長胃癌患者的生存期。因此，對胃癌高危人群的預(yù)斷尾采血、分離血清，采用間接ELISA法檢測，用瓊測及篩查就顯得尤為重要。國內(nèi)外胃癌標(biāo)志物的研擴(kuò)試驗進(jìn)行復(fù)檢。采用同種未免疫小鼠血清作為陰究已廣泛開展并取得了

5、一定的進(jìn)展。當(dāng)胃黏膜發(fā)生性對照。病變時，血清中PGI、PGⅡ的含量也隨之發(fā)生改1．2．2胃蛋白酶原Ⅱ抗原單克隆的建立選取產(chǎn)變。據(jù)文獻(xiàn)報道，血清PG工／PGlI比值可作為胃生高抗體效價的小鼠脾臟B細(xì)胞作為融合細(xì)胞。融癌高發(fā)的預(yù)測指標(biāo)，因此，檢測血清PG工、PG11的合前1d制備飼養(yǎng)細(xì)胞。采用SP2／o缺陷性細(xì)胞株含量對胃癌的篩查及早期診斷具有重要的意義_4]。與脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合。融合7d后，采用間接本試驗制備配對的PG1I單克隆抗體，為建立PGIIELISA檢測融合細(xì)胞分泌抗體水平。對高抗體水定量檢測ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。平的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞株克隆化]，選1材料與方法

6、出細(xì)胞狀態(tài)良好的單克隆株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，液氮凍1．1材料存。胃蛋白酶原Ⅱ抗原、福氏完全佐劑(FCA)和福1．2．3單抗腹水的制備取12周齡Balb／c雌鼠，氏不完全佐劑(IFA)，購于Sigma公司；酶標(biāo)兔抗鼠按每只0．5mL、雜交瘤細(xì)胞濃度為1×1O個／mL收稿日期：2Ol1-12-16基金項目：河南省科技創(chuàng)新團(tuán)隊和鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊項目作者簡介：張紅緒(1955一)，男，河南洛陽人，教授，主要從事哺乳動物消化道腫瘤分子生物學(xué)研究。*通訊作者張紅緒等：胃蛋白酶原Ⅱ單抗制備及夾心ELISA的初步建立57腹腔注射，1周左右、待產(chǎn)生明顯腹水時收集腹水。進(jìn)行試驗。1．2．4單克隆抗體的

7、純化及測定參考劉曉波j1．2．7初步建立PG1I的雙抗體夾心ELISA檢測的抗體純化方法，對收集的腹水進(jìn)行純化，采用采用棋盤滴定法嘲，初步確定PG1的雙抗體夾心SDS—PAGE鑒定蛋白的純度。ELISA中包被單抗和自制酶標(biāo)抗體的最佳工作濃1．2．5單克隆抗體亞型的初步鑒定間接ELISA度，用PG1檢測試劑盒檢測胃癌陽性血清的PG1測定，以抗原PG1100ng／~L包被酶標(biāo)板，按行分別含量，作為定值標(biāo)本，空白孔作為陰性對照。加入篩選出陽性細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液，37。C溫育3O2結(jié)果m