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1、電泳技術(shù)概述電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程。許多更要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核昔酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子木身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒有固定支
2、持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對(duì)流都比較強(qiáng)，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程，減少了擴(kuò)散和對(duì)流等干擾作用。最初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜，0前這些介質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用得較少。在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，小分子物質(zhì)如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進(jìn)行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來進(jìn)行分析。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì)，操作簡(jiǎn)單、方便。但對(duì)于復(fù)雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳
3、技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。電泳裝置主要包括兩個(gè)部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm14cm,厚度為1mm?2?mm,近年
4、來新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節(jié)省試劑和縮短電泳時(shí)間。制膠時(shí)在凝膠溶液中放一個(gè)塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會(huì)引起帶電分子電荷的改變，進(jìn)而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定。為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的，下面簡(jiǎn)單介紹一下電泳的基本原理。在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓（V）,就會(huì)在電極
5、中間產(chǎn)生電場(chǎng)強(qiáng)度（E）,L是電極間距離。在稀溶液中，電場(chǎng)對(duì)帶電分子的作用力（F）,等于所帶凈電荷與電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積。這個(gè)作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過程中，分子會(huì)受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力（F'）的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動(dòng)速度成正比，對(duì)于球狀分子，F(xiàn)'的大小服從Stokes定律，艮lbF'=6nrnu式中r是球狀分子的半徑，n是緩沖液粘度，u是電泳速度（U=d/t,單位時(shí)間粒子運(yùn)動(dòng)的距離，cm/s)。當(dāng)帶電分子勻速移動(dòng)口寸：
6、F=F',q?E=6nrnu由此可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，實(shí)際使用的是相對(duì)遷移率mR。帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。即使兩個(gè)分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳；而有些類型的電泳則
7、主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標(biāo)記，則可以通過放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測(cè)。凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度
8、和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好，其分辯力極高,甚至相差lbp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對(duì)大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前，一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。瓊脂糖凝膠電泳原理：瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D一半乳糖和3,6脫水L一半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液
