《電泳技術(shù)》課件

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1、電泳技術(shù)目錄第一節(jié)區(qū)帶電泳第二節(jié)等電聚焦電泳第三節(jié)SDS-PAGE電泳第四節(jié)二維電泳第五節(jié)印跡技術(shù)第六節(jié)免疫電泳第七節(jié)高效毛細(xì)管電泳技術(shù)第八節(jié)電泳分析儀基本原理不同性質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)，由于帶電性質(zhì)及電量不同，在一定電場強(qiáng)度下移動(dòng)的方向和速度亦不同。蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)等電點(diǎn)pH>等電點(diǎn)帶負(fù)電pH<等電點(diǎn)帶正電質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量越多（介質(zhì)的pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)）質(zhì)點(diǎn)的直徑越小越接近球形則它在電場中的泳動(dòng)速度越快，遷移率亦越大。基本原理區(qū)帶電泳檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用－－血清蛋白電泳圖6-1正常血清蛋白電泳圖譜上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條

2、帶的主要組分；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HP：觸珠蛋白；CP：銅藍(lán)蛋白Alb：清蛋白α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白β：運(yùn)鐵蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、β脂蛋白γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE區(qū)帶電泳圖6-2幾種常見異常血清蛋白圖譜A：雙清蛋白血清電泳圖；B：慢性肝病或肝硬變常見的?-?融合的橋連現(xiàn)象；C：免疫球蛋白寡克隆增生型；D：M蛋白血清型（IgA型）；N：正常對(duì)照血清；P：患者血清ABCD區(qū)帶電泳檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用－－同工酶電泳圖6-3LDH同工酶區(qū)帶電泳圖譜左：5份血清

3、iso-LDH電泳圖；右：iso-LDH電泳示意圖第一節(jié)區(qū)帶電泳檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用－－同工酶電泳圖6-4CK同工酶示意圖左：血清iso-CK電泳圖，3示正常血清（CKMB<5%），1、2、4示急性心梗（CKMB>5%）；4示CKBB陽性；右：iso-CK電泳圖譜示意圖區(qū)帶電泳實(shí)驗(yàn)原理讓pH>pI（max）所有蛋白質(zhì)帶負(fù)電各種蛋白質(zhì)帶電量不同電泳速度不同經(jīng)過一段時(shí)間電泳后，各種蛋白質(zhì)被區(qū)分開區(qū)帶電泳圖6-1正常血清蛋白電泳圖譜上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HP：觸珠蛋白；CP：銅藍(lán)

4、蛋白Alb：清蛋白α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白β：運(yùn)鐵蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)、β脂蛋白γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE第二節(jié)等電聚焦電泳檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用－－次級(jí)同工酶的分離圖6-5堿性磷酸酶同工酶等電聚焦電泳圖譜左：iso-ALP等電聚焦示意圖；右：膽道梗阻性疾病iso-ALP電泳圖譜第二節(jié)等電聚焦電泳區(qū)帶電泳的原理是不同的蛋白質(zhì)有不同的電泳速度那么可不可以有另外一種方法：使得不同蛋白質(zhì)在泳道中本來就有“固定”位置，蛋白質(zhì)在相應(yīng)的位置上停留？蛋白質(zhì)如何能夠停止電泳？除了切

5、斷電源之外？蛋白質(zhì)不帶電了——蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)溶液中第二節(jié)等電聚焦電泳基本原理在等電聚焦電泳時(shí)必須有一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度介質(zhì)，使pH值從正極向負(fù)極漸次增加，形成一線性pH梯度。蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的電泳管中，在電場中經(jīng)一定時(shí)間后，混合物中各組分將分別聚焦在與各等電點(diǎn)相應(yīng)的pH介質(zhì)區(qū)域，形成分離的各種蛋白質(zhì)區(qū)帶。這就是等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)的基本原理。第三節(jié)SDS-PAGE電泳等電聚焦根據(jù)等電點(diǎn)將蛋白質(zhì)分離那還能不能根據(jù)其他性質(zhì)將蛋白質(zhì)分離?區(qū)帶電泳的電泳速度的影響條件較多（大小、電荷、形狀），不是根據(jù)單一性質(zhì)分離有一

6、種方法能根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量使之帶上相應(yīng)的電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)本身電荷的大小，并使電荷成為電泳速度的主要決定因素，那么電泳速度只和分子量相關(guān)第三節(jié)SDS-PAGE電泳SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)負(fù)載了大量負(fù)電荷，大大超過了天然蛋白質(zhì)的原有電荷，因此蛋白質(zhì)之間原有電荷的差異就無顯著效應(yīng)，蛋白質(zhì)帶電量的多少，只與蛋白質(zhì)大小即分子量有關(guān)，此時(shí)，不同泳動(dòng)速率僅反映了各蛋白質(zhì)亞基的分子量的差別。第三節(jié)SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用－－非濃縮尿蛋白電泳圖6-7非濃縮尿蛋白電泳示意圖第三節(jié)SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中

7、的應(yīng)用－－非濃縮尿蛋白電泳圖6-8臨床常見蛋白尿電泳圖譜左：腎小球性蛋白尿；中：腎小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，腎小管性蛋白尿?yàn)橹餍?；右：混合型蛋白尿一個(gè)條帶中仍是混合著多種蛋白質(zhì)，如何再把它們分開呢？第四節(jié)二維電泳圖6-9二維電泳原理及流程圖第四節(jié)二維電泳基本原理第一維電泳，即等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)其基本原理是利用蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn)的不同對(duì)其進(jìn)行分離；第二維電泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。第四節(jié)二維電泳檢

8、驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一個(gè)問題：如何確定某個(gè)條帶是什么蛋白質(zhì)？圖6-1正常血清蛋白電泳圖譜上圖：箭頭示電泳方向，右側(cè)示各條帶的主要組分；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HP：觸珠蛋白；CP：銅藍(lán)蛋白第五節(jié)印跡技術(shù)免疫印跡法－－基本原理圖6-13免疫印跡法的原理第五節(jié)印跡技術(shù)免疫印跡法（Immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡