巢式PCR注意事項(xiàng).doc

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1、巢式PCR注意事項(xiàng)巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，這兩組(而非一對)PCR引物可用來擴(kuò)增片段。第一對PCR引物擴(kuò)增的片段與片段準(zhǔn)相近。第二對引稱為巢式引物(因?yàn)樗麄兂睬对诘谝黄蝺?nèi)部)。與第一段PCR產(chǎn)物結(jié)合，來指導(dǎo)第二段PCR產(chǎn)物的合成，這段產(chǎn)物比第一段產(chǎn)物要短。巢式PCR的好處是，如果錯誤的PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增，那么由第二段引物指導(dǎo)的第二次擴(kuò)增的產(chǎn)物錯誤的可能性將是非常低的。巢式聚合酶鏈反應(yīng)，巢式PCR需要兩套引物用于放大特定的DNA片，應(yīng)用兩次單獨(dú)的PCR來進(jìn)行。第二對引功能擴(kuò)增較小的特定DNA片段，該

2、片段位于一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部。因此，巢式PCR擴(kuò)增是非常特異的。第一步:目標(biāo)DNA片段與第一段引物（蘭色）結(jié)合。引物可能回選擇性的結(jié)合于模板，相似的引物結(jié)合位點(diǎn)會產(chǎn)生多重的產(chǎn)物，然而，只有一段產(chǎn)物是我們預(yù)期的。第二步：應(yīng)用一次PCR產(chǎn)物區(qū)段，通過二次新的引物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行二次PCR（紅色）。這些引物嵌套在一次PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，因此，非特異性片段的產(chǎn)生是不太可能的，一次PCR產(chǎn)物包含著二次PCR引物的結(jié)合位點(diǎn)。這種巢式PCR產(chǎn)物保證了通過二次PCR得到的產(chǎn)物很少有或者沒有污染（雜帶，也就是產(chǎn)物是符合我們需要的）也就是沒有非特

3、異性的條帶。注意事項(xiàng)：1。如果要提高擴(kuò)增效果，具備回收的條件的話，回收后繼續(xù)第二次PCR是沒有問題的。如果不具備回收條件，不回收直接稀釋后進(jìn)行二次PCR也可，因?yàn)閮?nèi)引物同樣具有相當(dāng)?shù)奶禺愋?，如果設(shè)計(jì)合理，第一次非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，不能和第二對引物有效結(jié)合，這樣的非特異產(chǎn)物的模板不能在第二次擴(kuò)增中產(chǎn)生目的條?帶。這也正是NESTED?PCR的優(yōu)點(diǎn)。??2。主要是控制好引物的比例，也就是說，如果第一次PCR的?引物如果過量的話，剩余引物二次PCR的時候同樣能有一定的產(chǎn)量，這相對于第二次PCR而言就是非特異性的產(chǎn)物。解

4、決的方法很簡單，第一次PCR時，引物?盡量摸索最低的加入量，增加循環(huán)次數(shù)，盡量消耗體系中殘余的引物。二次PCR時，增加內(nèi)引物的量，二者還是有一定競爭關(guān)系，道理不言而喻了。