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《擬穴青蟹ANT2基因的克隆與低溫脅迫表達分析.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第53卷第3期廈門大學學報(自然科學版)Vol
2、53NO．32014年5月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)May2014擬穴青蟹ANT2基因的克隆與低溫脅迫表達分析于坤，葉海輝，鞏杰，黃輝洋，林思恒(廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102)摘要：腺苷酸轉移酶(ANT)是線粒體中最豐富的蛋白質(zhì)之一，其主要作用是介導ADP／ATP在細胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)之間的運輸．為探討該基因在擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)低溫適應中的作用，采用反轉錄PCR(RTPCR)、eDNA末端快速擴增技術(RACE)等技術，從擬穴青蟹中獲得了ANT
3、2的cDNA全長序列，并運用實時熒光定量PCR(qPCR)技術檢測了ANT2在不同組織和不同溫度下的表達譜．該序列全長1348bp，開放閱讀框(ORF)為930bp，編碼309個氨基酸殘基．同源分析顯示，該蛋白具有3個保守的線粒體跨膜功能結構域，形成能量分子傳導轉運通道，催化細胞質(zhì)中ADP和線粒體內(nèi)ATP的跨膜交換．qPCR結果表明ANT2基因在擬穴青蟹多個組織中均有表達，且表達量不同，表明ANT2基因具有組織表達特異性．第1期仔蟹在10，15，20，25℃不同溫度條件下，在1，3，12，24，36h，10和15C組表達量顯著低于2O和25℃組(Pd0．05)；且在1，3，6。12，24h
4、，10。C組的表達量顯著低于15℃組表達量(d0．05)．15C組在48h內(nèi)，ANT2呈現(xiàn)高低起伏的表達模式．擬穴青蟹第1期仔蟹ANT2基因表達變化，提示該基因與能量代謝功能相關，可能參與擬穴青蟹低溫脅迫應答．關鍵詞：擬穴青蟹；ANT2；低溫脅迫；實時熒光定量PCR(qPCR)中圖分類號：Q785；S917．4文獻標志碼：A文章編號：04380479(2014)03043607低溫作為一種外界環(huán)境因子會改變生物機體內(nèi)有研究表明，ANT2基因與生物體耐寒機理相關，環(huán)境的穩(wěn)定性，進而影響生物的生理和行為等．在低溫可能參與調(diào)控生物機體的耐寒生理過程．有關甲殼動脅迫下，生物主要活動是增加產(chǎn)熱，以維
5、持恒定的體物ANT的研究尚少．據(jù)報道，豐年蝦(Artemiafran溫l1]，同時生物體能夠啟動與抗低溫相關的基因，使ciscana)胚胎中的ANT蛋白與鈣離子運輸密切相組織細胞內(nèi)抗低溫相關蛋白的表達發(fā)生變化_2，從而關[9]．凡納濱對蝦(LitopenaeusvanHaei)ANT2基抵抗低溫環(huán)境對機體產(chǎn)生的影響．因表達變化可能與低溫脅迫有關【腺苷酸轉移酶(adeninenucleotidetranslocase，迄今，有關溫度對甲殼動物生理生態(tài)的影響，國內(nèi)ANT)是線粒體中最豐富的蛋白質(zhì)之一，它將線粒體外已有不少研究報道_l，但擬穴青蟹(Scyllapara內(nèi)合成的三磷酸腺苷(ATP)
6、轉運到胞漿供能，并將胞mamosain)與低溫相關性尤其在基閑水平的報道很漿二磷酸腺苷(ADP)轉入線粒體內(nèi)通過氧化磷酸化少I”]．擬穴青蟹是我國東南沿海重要的海洋經(jīng)濟蟹類之一[1產(chǎn)能J．ANT蛋白由兩個完全相同，分別含一個．作為暖水性種類，在季節(jié)交替或低溫寒潮發(fā)生期間，擬穴青蟹不適應低溫環(huán)境，嚴重時會發(fā)生病害引起ATP／ADP結合位點的亞基組成，通過其構象的變化，死亡[1．本研究采用cDNA末端快速擴增技術(rapid實現(xiàn)細胞質(zhì)中ADP和線粒體內(nèi)ATP間的跨膜交amplificationofcDNAends，RACE)技術得到擬穴青蟹換l4]．生物體大約1／2～l／3的基礎電子傳遞由AN
7、TANT2基因全長，并運用實時熒光定量PCR(qPCR)技術催化，是保持細胞內(nèi)能量代謝的關鍵成分j．在人類中檢測其在各個組織及在低溫脅迫下的表達情況．本研究可發(fā)現(xiàn)ANT蛋白有多種同型異構體。并且不同異構為擬穴青蟹低溫生理研究提供科學資料．對其健康養(yǎng)殖體有著不同的染色體定位和組織表達模式．近年來以及分子育種也具有一定的指導意義．1材料與方法收稿日期：2Ol3一l203基金項目：福建省自然科學基金(2012J01147)；福建省科技計劃重點項目(2oo8N()(14o)1．1實驗動物*通信作者：haihuiye@xmu．edu．cn擬穴青蟹成體來源：購買于廈門市第八水產(chǎn)品市第3期于坤等：擬穴青
8、蟹ANT2基因的克隆與低溫脅迫表達分析場，甲殼長度為7．2～8．8cm，體質(zhì)量為200～350g，(NanoDrop2000)檢測RNA的純度及濃度．總RNA實驗室暫養(yǎng)1d，水溫為(28．0±0．5)。C．滿足質(zhì)量要求后，取2g總RNA，參照RevertAidTM擬穴青蟹第1期仔蟹的來源：從天然海區(qū)捕撈擬FirstStrandcDNASynthesisKit試劑說明書，進行反穴青蟹的大眼幼體，在實驗室內(nèi)(水溫(28．0±
