酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)AFP――ELISA雙抗體夾心法.ppt

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1、ELISA綜合性實(shí)驗(yàn)二綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案探討ELISA最佳工作濃度的選擇——此次試驗(yàn)提供0.5mg/mL的包被抗體原液每組300μl(經(jīng)過(guò)一系列的預(yù)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在我們抗體包被的濃度范圍縮小為10μg/mL～60μg/mL)?！挥肗a2CO3緩沖液每組各10ml——酶標(biāo)抗體稀釋液、抗原稀釋液每組10ml——1:50酶標(biāo)抗體液每組100μl（預(yù)實(shí)驗(yàn)后工作濃度范圍縮小在1:2000～1:10000之內(nèi)）——800μg/mL的檢測(cè)抗原原液每組800μl（自己調(diào)整檢測(cè)濃度，此次試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性抗原為400μg/mL、弱陽(yáng)性抗原濃度為20μg/mL、陰性直接加抗原稀釋液）——聚苯乙烯酶標(biāo)板條3條，共36

2、孔實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)操作要求包被抗體、酶標(biāo)抗體、檢測(cè)抗原濃度的確立；聚苯乙烯板條每孔加包被抗體液100μL，4℃包被48h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加200μL封閉液，4℃封閉24h。棄去封閉液，風(fēng)干，檢測(cè)（檢測(cè)時(shí)每孔所加的各稀釋度的酶標(biāo)液和抗原都為100μL），結(jié)果分析。標(biāo)本檢測(cè)的原理將特異性抗體包被固相載體，加入受檢標(biāo)本（抗原）使之與固相載體上的抗體結(jié)合成抗體抗原復(fù)合物，加入酶標(biāo)抗體形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物顯色。實(shí)驗(yàn)材料與儀器待檢抗原原液、酶標(biāo)抗體、抗原稀釋液、酶標(biāo)稀釋液、酶標(biāo)板條、洗滌液、顯色液A、顯色液B、終止液滴管、吸管、微量加樣器、移液管酶標(biāo)儀、溫育箱操作在酶標(biāo)板條的孔中加入相應(yīng)

3、濃度的抗原（100UL/孔）↓37℃×30min棄孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3遍，30s/次↓拍干加所設(shè)計(jì)的不同工作濃度的酶標(biāo)抗體100UL/孔↓37℃×30min棄去孔內(nèi)液體，同上洗滌三次↓拍干加底物A、B液各2滴(100UL/孔)↓37℃×15min顯色后加終止液1滴(50UL/孔)↓酶標(biāo)比色儀450nm讀取OD值棋盤滴定法選擇最佳工作濃度選擇標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽(yáng)性參考血清A值為0.8左右陰性參考血清A值<0.1（即：選擇強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照孔最接近0.8，且陰性孔小于0.1的孔所對(duì)應(yīng)的包被濃度和酶標(biāo)濃度為最佳的ELISA檢測(cè)濃度。）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求在實(shí)驗(yàn)本上繪出36孔設(shè)計(jì)圖表寫出實(shí)驗(yàn)中選擇的包被液的情況寫出實(shí)驗(yàn)

4、中選擇的包被抗體、酶標(biāo)抗體、檢測(cè)抗原的濃度，和系列稀釋方案。寫出最終測(cè)得的OD值并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。123456789101112評(píng)價(jià)雙抗體夾心ELISA法簡(jiǎn)單易行，不需復(fù)雜的儀器設(shè)備，特異性強(qiáng)、敏感性高，其中一步法更簡(jiǎn)單、省時(shí)，但有Hook效應(yīng)的缺點(diǎn)。Ab＋Ag＋Ab*?Ab?Ag?Ab*＋Ab?Ag＋Ag?Ab*＋Ab*?Ag?Ab*abcdAb＋Ag?Ab?Ag（b復(fù)合物）(1)Ab?Ag＋Ab*?Ab?Ag?Ab*（a復(fù)合物）(2)HooK‘S效應(yīng)（鉤狀效應(yīng)）ELISA影響因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第一組：邊緣效應(yīng)第二組：疊加效應(yīng)第三組：溫浴方式第四組：加樣方式第五組：洗滌次數(shù)第六組：溫浴時(shí)間第七

5、組：試劑溫度小組討論結(jié)束后每組寫出一份具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，下節(jié)課上每組派代表上臺(tái)講述實(shí)驗(yàn)方案和可行性，講述時(shí)間為2-3分鐘左右。要求設(shè)計(jì)方案中包括：實(shí)驗(yàn)對(duì)象、標(biāo)本要求操作條件、操作過(guò)程（可畫出96孔加樣示意圖或?qū)Ρ仁疽鈭D等）結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果分析方式謝謝！