冰凍切片與石蠟切片的區(qū)別.doc

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1、1．冰凍切片是免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片?！　”鶅鰰r，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組織結(jié)構損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組織結(jié)構影響愈嚴重。因此，應盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認為冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C,從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加

2、達1018，然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成?！　。?）速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43。C的時間，減少冰晶的形成。其方法有二：　?、俑杀?丙酮（酒精）法：將150-200ml丙酮（酒精）裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可達-70℃C，用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精）飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達-70℃時即可使用。將組織（大小為1cm×0.8cm×0.5cm）投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80℃低溫冰箱內(nèi)貯存?！　、谝旱ǎ簩⒔M織塊平放于軟塑

3、瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機冰凍切片?！　。?）將組織置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量?！　∮绊懕鶅銮衅囊蛩剌^多，因此，技術難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質(zhì)量的關鍵。目前冰凍切片機有兩類：　?、俸懵鶅銮衅瑱C（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機，型號很多，但其基本結(jié)構是將切片機置于-30℃C

4、低溫密閉室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4μm，完全能滿足免疫組織化學標記要求。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15℃～18℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動?！　、陂_放式冰凍切片機：包括半導體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術難度大，在高溫季節(jié)　，切片更加困難，且切片厚8～15μm，不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點是價廉，國內(nèi)有生產(chǎn)?！　”鶅銮衅笕绮蝗旧?，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預固定后貯存冰箱保存。　　2．石蠟切片　其優(yōu)點是組織結(jié)構保存良好，在病理和回

5、顧性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構清晰，抗原定位準確。用于免疫組化技術的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過程應在4℃。C下進行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應限于2cm×1.5cm×0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過程中，石蠟應保持在60℃以下，以溶點低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋）?！　〗M織塊脫水、透明、浸蠟時間參考表1-3：表1-3組織塊處理時間表170%乙醇4℃3～4h280%乙醇4℃3～4h390%乙醇4℃2～3h495%乙醇Ⅰ4℃2～3h595%乙醇Ⅱ4℃1～2h6100%乙醇Ⅰ4℃1.5h7100%乙醇Ⅱ4℃1.5h8二甲苯

6、Ⅰ4℃0.5～1h9二甲苯Ⅱ4℃0.5１～1h10石蠟Ⅰ60℃1h11石蠟Ⅱ60℃2h　　以上全過程為18-24h，也可在室溫內(nèi)使用自動脫水機代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過程只需4h左右?！　∈炃衅瑸槌Ｒ?guī)制片技術，切片機多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2～7μm，應用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應入37℃恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4

7、℃冰箱內(nèi)備用?！　∈炃衅瑑?yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freezedryingembeddingmethed），可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機（Freezingdryer）在真空、低溫條件下排除組織內(nèi)水分，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后