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1、濃縮膠和分離膠的PH值不同，前者主要表現(xiàn)為濃縮效用，后者表現(xiàn)為電荷效用和分子篩效用。濃縮效應(yīng)主要在濃縮膠中完成，濃縮膠的pH6.8，在這個pH條件下，緩沖液中的HCl的Cl離子幾乎全部解離，Gly的等電點(diǎn)為6.0，僅少數(shù)解離為負(fù)離子，在電場中移動速度很慢。酸性蛋白質(zhì)在此pH下解離為負(fù)離子，三類離子的遷移速率為Cl>一般蛋白質(zhì)>Gly，電泳開始后，Cl離子泳動快，在其后留下一個低離子濃度區(qū)。Gly在電場中移動很慢，造成移動離子的缺乏，于是快慢離子間就形成了一個缺少離子的高壓區(qū)，在高壓區(qū)內(nèi)所有的負(fù)離子都會加速移動，當(dāng)移到Cl離子區(qū)域時，高電壓消失，蛋白
2、質(zhì)的移動速度慢下來，當(dāng)以上穩(wěn)定狀態(tài)建立后，蛋白質(zhì)樣品在快慢離子間被濃縮形成一個狹小的之間層，并按蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷量的多少依次排列成帶，濃縮樣品，從濃縮膠進(jìn)入分離膠后，膠的pH升高，Gly的離解度增大，泳動率上升，又因為它分子小，故超過所有的蛋白質(zhì)分子，緊跟在Cl離子后，Cl離子遷移后，低離子濃度不再存在，形成了恒定的電場強(qiáng)度，因此，蛋白質(zhì)樣品在分離膠中的分離主要取決于它的電荷性質(zhì)，分子大小和形狀，分離膠的孔徑有一定大小，對不同相對質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說，通過時收到的滯阻作用不同，即使靜電荷相等的顆粒，也會由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。
3、10％和12％膠的差別：根據(jù)你目的蛋白分子量而定，如果說是分子量較大的蛋白（60KD以上），可以用10％的膠，分子量在60～30KD之間的可以用12％的膠，低于30KD的我一般都是用15％的膠了。主要在于指示線剛好跑出膠底的時候，你的目的蛋白能夠恰好處于膠的中間部分。凝膠的濃度大小不同所對應(yīng)的凝膠孔徑大小也不同，濃度小的孔徑大，濃度大的孔徑小，一般分離膠用12%的，濃縮膠用5%的，因為濃縮膠的目的就是將所有的蛋白濃縮在同一起跑線上，然后一塊進(jìn)入分離膠分離。據(jù)蛋白大小定。WesternBlot轉(zhuǎn)膜在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。膜
4、的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。A半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。1實驗條件的選擇電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃
5、度選擇轉(zhuǎn)移時間具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。目的蛋白分子大小(kDa)膠濃度轉(zhuǎn)移時間80---1408%1.5-2.025---8010%1.515—4012%0.75<2015%0.52實驗操作（1）濾紙和膜的準(zhǔn)備(在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作)。A.檢查是否有足夠的transferbuffer，沒有立即配制。B.檢查是否有合適大小的濾紙和膜。C.將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transferbuffer中。D.將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transferbuffer中。PDVF膜在進(jìn)轉(zhuǎn)移緩沖液時，要在甲醇里面泡多長時間?PVDF是
6、疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤。PVDF的預(yù)處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉(zhuǎn)入蒸餾水洗兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。一般5-20分鐘都有人在用。可在取膠的同時泡，估計前后5分鐘左右。效果還不錯。以前有站友發(fā)貼，說處理時間沒多大關(guān)系，關(guān)鍵看膜的質(zhì)量．確實是這樣的。只要讓膜完全浸透應(yīng)該就沒問題了。Hybond的PVDF說明書這樣的寫的：“pre-wetthemembranein100%methanol(10seconds)”。我的理解是，至少10秒鐘，多泡下也沒關(guān)系的
7、，事實上，泡10秒的做過，10分鐘的也做過，都沒有問題的。（2）轉(zhuǎn)移A.在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。B.將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的濕潤。C.將膠剝出，去掉stackgel，小心的移到膜上。D.剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。E.將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。倒上些transferbuffer，再鋪兩張靠膠濾紙。F.裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時間。G.轉(zhuǎn)移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時調(diào)整。3注意事項及常遇到的問題：1）濾紙、膠、膜之間的大
8、小，一般是濾紙>=膜>=膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全
