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1、慢病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法1/4一、實(shí)驗(yàn)概述培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞，根據(jù)慢病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)各組實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行正式感染。若為熒光標(biāo)記的慢病毒感染，參照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的感染時(shí)間點(diǎn)，于熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，熒光率達(dá)70-80％左右，細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，收集細(xì)胞進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。若為抗性基因（如Puromycin）標(biāo)記的慢病毒感染，感染48h-72h后，使用抗生素篩選48h，收集細(xì)胞匯合度70%-80%左右的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)材料1.主要試劑試劑名稱試劑來源cat.No.胎牛血清Ausbia
2、nVS500TDMEMCorning10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50GPuromycinClontech631305D-Hanks上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司配制2.主要儀器儀器名稱儀器來源cat.No.熒光顯微鏡奧林帕斯IX71CO2培養(yǎng)箱日本三洋SANYOMCO-175倒置顯微鏡上海蔡康光學(xué)儀器有限公司XDS-100離心機(jī)賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司Fresco21生物安全柜上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司Bio1200-Ⅱ-A2三、實(shí)驗(yàn)步驟1．準(zhǔn)備目的細(xì)胞（1）從液氮罐中取出
3、細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中，并丌時(shí)搖動(dòng)使其盡快解凍。（2）完全解凍后，1300rpm，離心3min，75%酒精擦拭凍存管消毒后，移至生物安全柜。（3）吸去凍存液上清，加入1mL新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至含有3mL完全培養(yǎng)基的6-cmdish中，輕輕晃勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。（4）24h后更換一次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右傳代培養(yǎng)，保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。2/42．目的細(xì)胞慢病毒感染（1）貼壁細(xì)胞：a.處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成3-5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸
4、液，并根據(jù)表1接種相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)到培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時(shí)鋪板量達(dá)到15-30%左右。表1.貼壁細(xì)胞接種和病毒感染時(shí)感染液體積底面積接種體積換液體積296孔板0.3cm100μl100μl248孔板0.6cm200μl200μl224孔板2cm500μl500μl212孔板4cm1ml500μl26孔板10cm2ml1ml2T25瓶25cm5ml2.5mlb.按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考表1更換感染培養(yǎng)基，加入最適病毒量進(jìn)行感染。c.參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇感染后最適時(shí)間點(diǎn)更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一般為感染后8-12h左右。
5、（2）懸浮細(xì)胞：a.按照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的感染條件，使用感染液將細(xì)胞制成3-5×105個(gè)/mL懸液，并根據(jù)表2接種相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)到培養(yǎng)板中。表2.懸浮細(xì)胞接種體積底面積接種體積248孔板0.6cm200μl224孔板2cm500μl212孔板4cm1mlb.鋪板后無需培養(yǎng)，參照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的MOI加入最適病毒量感染。c.參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇感染后最適時(shí)間點(diǎn)，一般為8-12h左右，將各孔中細(xì)胞收集到干凈的1.5mlEP管中，以2000rpm離心2min，去掉上清液，更換為完全培養(yǎng)基，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)（備注：如48孔板感染可擴(kuò)大
6、至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)）。3．觀察感染后細(xì)胞狀態(tài)及感染效率（1）細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，特別是保證NC組不CON組細(xì)胞狀態(tài)相當(dāng)。（2）一般而言，細(xì)胞感染效率達(dá)到70%以上，就可以繼續(xù)下游實(shí)驗(yàn)。a.熒光標(biāo)記的慢病毒感染。感染后72h左右，熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因（如GFP）的表達(dá)情況，熒光率即為陽(yáng)性感染率；b.抗性基因標(biāo)記的慢病毒感染。一般于感染48-72h后，換用含抗生素（如3/4puromycin)的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞，細(xì)胞存活率即為陽(yáng)性感染率。4．細(xì)胞狀態(tài)良好，感染效率合格組，可用于下游檢測(cè)；否則重新感染。注：操
7、作時(shí)污染了病毒的管子和槍頭以及培養(yǎng)基和最后的細(xì)胞都需要用消毒液處理后才能丟棄。4/4
