蛋白表達(dá)及純化課件.ppt

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1、蛋白表達(dá)、純化抗體制備應(yīng)用及ELISA間接法盧士強(qiáng)2010-11-18Part1:蛋白表達(dá)、純化蛋白表達(dá)流程目的基因cDNA表達(dá)宿主載體設(shè)計(jì)引物連接轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)蛋白純化鑒定保存geneCell-freeBacterialYeastInsectMammalianHostExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(

2、24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylat

3、ionnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序,共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)

4、內(nèi)含有種類(lèi)繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)Vector二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體：復(fù)制起點(diǎn)(ori)多克隆位點(diǎn)。篩選標(biāo)記（抗菌素抗性基因、Tag、篩選標(biāo)記）控制和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細(xì)胞中表達(dá),它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動(dòng)子有效控制下?？墒雇庠椿蚋咚奖磉_(dá)的最佳啟動(dòng)子必須具備以下幾個(gè)條件1)強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式,使用廉價(jià)的

5、誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。常用的大腸桿菌表達(dá)載體啟動(dòng)子：λ噬菌體的PL啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動(dòng)子色氨酸操縱子trp啟動(dòng)子pBR322質(zhì)粒的beta－內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子a:如果在克隆基因編碼區(qū)的3?末端之后，接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過(guò)位于下游另一個(gè)啟動(dòng)子b:如果在啟動(dòng)子的上游部位放置一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會(huì)被限制在最低本底水平。c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。d:在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常是添加全部終止密碼子,阻止核

6、糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。e:大腸桿菌格外偏愛(ài)使用終止密碼子UAA,當(dāng)其后連上一個(gè)U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會(huì)得到進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)譯起始序列a:mRNA的5?末端之獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。b:在構(gòu)建外源基因的高效表達(dá)載體時(shí),需認(rèn)真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。c:未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)(KOZAKSEQUENCE)篩選標(biāo)記:其編碼產(chǎn)物可被快速測(cè)定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞同任何一種目的啟動(dòng)子連接,其表達(dá)活性可作為檢

7、測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。β－半乳糖苷酶基因lacZ熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)Tag-目的基因保護(hù)堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護(hù)堿基Xgene引物的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。上游、下游引物引入酶切位點(diǎn)oligo6RNA提?。篢RNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNAmarker；2：X基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖1.1X基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物GenecloningYourdestinationvectorR1R2Yourline

8、arizedvectorX基因R1R2+1.雙酶切目的基因和載體及切膠回收：附件目的基因保護(hù)堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護(hù)堿基2.連接轉(zhuǎn)化：附件3.雙酶切鑒定：附件4.測(cè)序：附件1：DNAmarker;2：重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切;3：空質(zhì)粒pET28a雙酶切圖1.3重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切鑒定圖1.4X基因發(fā)生點(diǎn)突變(AGU→AGC)，但為